Μονωτής (γενετική)

Οι μονωτές έχουν δύο κύριες λειτουργίες:^[3][4]

1. Οι μονωτές που μπλοκάρουν ενισχυτές εμποδίζουν τους περιφερικούς ενισχυτές να δράσουν στον προαγωγέα των γειτονικών γονιδίων
2. Οι μονωτές φραγμού εμποδίζουν τη σίγαση της ευχρωματίνης από την εξάπλωση της γειτονικής ετεροχρωματίνης

Ενώ ο φραγμός ενισχυτή ταξινομείται ως διαχρωμοσωμική αλληλεπίδραση, η δράση ως φραγμός ταξινομείται ως ενδοχρωμοσωμική αλληλεπίδραση. Η ανάγκη για μονωτές προκύπτει όταν δύο γειτονικά γονίδια σε ένα χρωμόσωμα έχουν πολύ διαφορετικά μοτίβα μεταγραφής. Είναι κρίσιμο οι μηχανισμοί επαγωγής ή καταστολής του ενός να μην παρεμβαίνουν στο γειτονικό γονίδιο.^[6]. Έχει επίσης βρεθεί ότι οι μονωτές συγκεντρώνονται στα όρια των τοπολογικά συσχετιζόμενων περιοχών (topologically associating domains, TADs) και μπορεί να διαδραματίζουν ρόλο στη διαίρεση του γονιδιώματος σε "γειτονιές χρωμοσωμάτων" - γονιδιωματικές περιοχές εντός των οποίων λαμβάνει χώρα ρύθμιση.^[7][8]Μερικά παραδείγματα διαφορετικών μονωτών είναι:^[3]

• Οι μονωτές της Drosophila melanogaster, τσιγγάνοι (gypsy) και scs scs είναι και οι δύο μονωτές που μπλοκάρουν ενισχυτές
• Το Gallus gallus έχει μονωτές, το Lys 5' A που έχουν δραστικότητα αποκλεισμού ενισχυτή και φραγμού, καθώς και το HS4 που έχει μόνο δράση αποκλεισμού ενισχυτή
• Οι μονωτές του Saccharomyces cerevisiae STAR και UAS_rpg είναι και οι δύο μονωτές φραγμού
• Στον Homo sapiens ο μονωτής HS5 δρα ως αναστολέας ενισχυτή

Μονωτές αναστολείς ενισχυτών

Παρόμοιος μηχανισμός δράσης για μονωτές φραγμού ενισχυτών. Οι περιοχές βρόχου χρωματίνης σχηματίζονται στον πυρήνα που διαχωρίζει τον ενισχυτή και τον προαγωγέα ενός γονιδίου στόχου. Οι περιοχές βρόχου σχηματίζονται μέσω της αλληλεπίδρασης μεταξύ στοιχείων αναστολέων ενισχυτή που αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, ή ασφαλίζουν την ίνα χρωματίνης σε δομικά στοιχεία εντός του πυρήνας.^[4] Η δράση αυτών των μονωτών εξαρτάται από την τοποθέτηση μεταξύ του προαγωγέα του γονιδίου στόχου και του ενισχυτή προς τα πάνω ή προς τα κάτω. Ο συγκεκριμένος τρόπος με τον οποίο οι μονωτές μπλοκάρουν τους ενισχυτές εξαρτάται από τον τρόπο δράσης των ενισχυτών. Οι ενισχυτές μπορούν να αλληλεπιδράσουν άμεσα με τους προαγωγείς-στόχους τους μέσω βρόχου^[9] (πρότυπο άμεσης επαφής), οπότε ένας μονωτής εμποδίζει αυτή την αλληλεπίδραση μέσω του σχηματισμού μιας περιοχής βρόχου που διαχωρίζει τις θέσεις ενισχυτή και προαγωγέα και εμποδίζει το σχηματισμό του βρόχου προαγωγέα-ενισχυτή.^[4] Ένας ενισχυτής μπορεί επίσης να δράσει σε έναν προαγωγέα μέσω ενός σήματος (πρότυπο παρακολούθησης της δράσης ενισχυτή). Αυτό το σήμα μπορεί να αποκλειστεί από έναν μονωτή μέσω της στόχευσης ενός συμπλόκου νουκλεοπρωτεϊνών στη βάση του σχηματισμού βρόχου.^[4]

Μονωτές φραγμού

Η δραστικότητα φραγμού έχει συνδεθεί με τη διακοπή συγκεκριμένων διεργασιών στον οδό σχηματισμού ετεροχρωματίνης. Αυτοί οι τύποι μονωτών τροποποιούν το νουκλεοσωμικό υπόστρωμα στον κύκλο αντίδρασης που είναι κεντρικός στον σχηματισμό ετεροχρωματίνης.^[4] Οι τροποποιήσεις επιτυγχάνονται μέσω διάφορων μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης της αφαίρεσης νουκλεοσώματος, κατά την οποία τα στοιχεία που αποκλείουν το νουκλεόσωμα διακόπτουν την ετεροχρωματίνη από εξάπλωση και τη αποσιώπηση (η αποσιώπηση προκαλείται από τη χρωματίνη). Η τροποποίηση μπορεί επίσης να γίνει μέσω της στρατολόγησης ακετυλομεταφορασών ιστόνης και συμπλοκών αναδιαμόρφωσης νουκλεοσωμάτων που εξαρτώνται από ΑΤΡ.^[4]

Ο μονωτής CTCF φαίνεται να έχει δραστικότητα αποκλεισμού ενισχυτή μέσω της τρισδιάστατης δομής του ^[10] και δεν έχει άμεση σχέση με τη δραστικότητα φραγμού.^[11] Ειδικά τα σπονδυλωτά φαίνεται να βασίζονται σε μεγάλο βαθμό στον μονωτή CTCF, ωστόσο υπάρχουν πολλές διαφορετικές αλληλουχίες μονωτών που έχουν εντοπιστεί.^[2] Οι μονωμένοι γείτονες (Insulated neighborhoods) που σχηματίζονται από τη φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ δύο θέσεων DNA που συνδέονται με CTCF περιέχουν τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ ενισχυτών και των γονιδίων-στόχων τους.^[12]

Ρύθμιση

Ένας μηχανισμός ρύθμισης του CTCF είναι μέσω μεθυλίωσης της αλληλουχίας DNA του. Η πρωτεΐνη CTCF είναι γνωστό ότι συνδέεται ευνοϊκά με μη μεθυλιωμένες θέσεις, επομένως προκύπτει ότι η μεθυλίωση των νησίδων CpG είναι ένα σημείο επιγενετικής ρύθμισης.^[2] Ένα παράδειγμα αυτού φαίνεται στον εντυπωμένο τόπο Igf2-H19, όπου η μεθυλίωση της πατρικής εντυπωμένης περιοχής ελέγχου (ICR) εμποδίζει τη δέσμευση του CTCF.^[13] Ένας δεύτερος μηχανισμός ρύθμισης είναι μέσω της ρύθμισης των πρωτεϊνών που απαιτούνται για την πλήρη λειτουργία των μονωτών CTCF. Αυτές οι πρωτεΐνες περιλαμβάνουν, αλλά δεν περιορίζονται στη συνεχίνη (cohesin), RNA πολυμεράση και CP190.^[2][14]

Το μονωτικό στοιχείο που βρίσκεται στο ρετρομεταθετόνιο gypsy της Δροσόφιλα είναι μία από τις πολλές αλληλουχίες που έχουν μελετηθεί λεπτομερώς. Ο μονωτής "τσιγγάνος" βρίσκεται στη 5' αμετάφραστη περιοχή (untranslated region, UTR) του στοιχείου ρετρομεταθετόνιο. Το "Gypsy" επηρεάζει την έκφραση γειτονικών γονιδίων που εκκρεμούν για εισαγωγή σε μια νέα γονιδιωματική θέση, προκαλώντας μεταλλαγμένους φαινοτύπους που είναι ειδικοί για τον ιστό και υπάρχουν σε ορισμένα αναπτυξιακά στάδια. Ο μονωτής πιθανότατα έχει ανασταλτική επίδραση στους ενισχυτές που ελέγχουν τη χωρική και χρονική έκφραση του προσβεβλημένου γονιδίου.^[15]

Τα πρώτα παραδείγματα μονωτών σε σπονδυλωτά παρατηρήθηκαν στον τόπο της β-σφαιρίνης του κοτόπουλου, cHS4. Το cHS4 σηματοδοτεί το όριο μεταξύ της ενεργού ευχρωματίνης στον τόπο της β-σφαιρίνης και της ανοδικής περιοχής ετεροχρωματίνης που είναι εξαιρετικά συμπυκνωμένη και ανενεργή. Ο μονωτής cHS4 δρα τόσο ως φράγμα στη σίγαση που προκαλείται από τη χρωματίνη μέσω της εξάπλωσης ετεροχρωματίνης και εμποδίζει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ ενισχυτών και προαγωγέων. Ένα διακριτικό χαρακτηριστικό του cHS4 είναι ότι έχει μια επαναλαμβανόμενη ετεροχρωματική περιοχή στο 5' άκρο του.^[5]Το ομόλογο του τόπου της ανθρώπινης β-σφαιρίνης του cHS4 είναι το HS5. Διαφορετικό από τον τόπο β-σφαιρίνης του κοτόπουλου, ο τόπος της β-σφαιρίνης του ανθρώπου έχει μια ανοιχτή δομή χρωματίνης και δεν πλαισιώνεται από ετεροχρωματική περιοχή 5'. Το HS5 πιστεύεται ότι είναι ένας γενετικός μονωτής in vivo καθώς έχει δραστικότητα αποκλεισμού ενισχυτή και δραστικότητα φραγμού διαγονιδίων.^[5]Το CTCF αρχικά χαρακτηρίστηκε για το ρόλο του στη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της β-σφαιρίνης. Σε αυτόν τον τόπο, το CTCF λειτουργεί ως πρωτεΐνη που δεσμεύει τον μονωτή και σχηματίζει ένα χρωμοσωμικό όριο.^[13] Το CTCF υπάρχει τόσο στον τόπο της β-σφαιρίνης του κοτόπουλου όσο και στον τόπο β-σφαιρίνης του ανθρώπου. Εντός του cHS4 του τόπου β-σφαιρίνης του κοτόπουλου, το CTCF δεσμεύεται σε μια περιοχή (FII) που είναι υπεύθυνη για τη δραστικότητα αποκλεισμού του ενισχυτή.^[5]

Αποτύπωση

Η ικανότητα των ενισχυτών να ενεργοποιούν τα αποτυπωμένα (imprinted) γονίδια εξαρτάται από την παρουσία ενός μονωτή στο μη μεθυλιωμένο αλληλόμορφο μεταξύ των δύο γονιδίων. Ένα παράδειγμα αυτού είναι ο αποτυπωμένος τόπος Igf2-H19. Σε αυτόν τον τόπο η πρωτεΐνη CTCF ρυθμίζει την αποτυπωμένη έκφραση δεσμεύοντας την μη μεθυλιωμένη μητρική εντυπωμένη περιοχή ελέγχου (ICR), αλλά όχι την πατρική ICR. Όταν δεσμεύεται στη μη μεθυλιωμένη μητρική αλληλουχία, το CTCF αποκλείει αποτελεσματικά τα κατάντη ενισχυτικά στοιχεία από την αλληλεπίδραση με τον προαγωγέα γονιδίου Igf2, αφήνοντας μόνο το γονίδιο H19 να εκφράζεται.^[13]

Μεταγραφή

Όταν ο μονωτής αλληλουχιών βρίσκεται σε κοντινή απόσταση από τον προαγωγέα ενός γονιδίου, έχει προταθεί ότι μπορεί να χρησιμεύουν για τη σταθεροποίηση των αλληλεπιδράσεων ενισχυτή-προαγωγέα. Όταν βρίσκονται πιο μακριά από τον υποκινητή, τα μονωτικά στοιχεία θα ανταγωνίζονται τον ενισχυτή και θα παρεμβαίνουν στην ενεργοποίηση της μεταγραφής.^[3] Ο σχηματισμός βρόχου είναι κοινός στους ευκαρυώτες για να φέρει τα απομακρυσμένα στοιχεία (ενισχυτές, προαγωγείς, περιοχές ελέγχου θέσης σε πιο κοντινή απόσταση για αλληλεπίδραση κατά τη μεταγραφή.^[4] Ο μηχανισμός των μονωτών που εμποδίζουν τον ενισχυτή τότε, εάν βρίσκεται στη σωστή θέση, θα μπορούσε να παίξει ρόλο στη ρύθμιση της ενεργοποίησης της μεταγραφής.^[3]

Οι μονωτές CTCF επηρεάζουν την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται σε διαδικασίες ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου που είναι σημαντικές για την κυτταρική ανάπτυξη, την κυτταρική διαφοροποίηση και τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση). Δύο από αυτά τα γονίδια ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου που είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν με το CTCF είναι τα hTERT και C-MYC. Σε αυτές τις περιπτώσεις, μια μετάλλαξη απώλειας λειτουργίας στο γονίδιο μονωτή CTCF αλλάζει τα μοτίβα έκφρασης και μπορεί να επηρεάσει την αλληλεπίδραση μεταξύ της κυτταρικής ανάπτυξης, της διαφοροποίησης και της απόπτωσης και να οδηγήσει σε καρκινογένεση, ή άλλα προβλήματα.^[2]Το CTCF απαιτείται επίσης για την έκφραση του γονιδίου ρετινοβλαστώματος (Rb) του καταστολέα όγκου και οι μεταλλάξεις και οι διαγραφές αυτού του γονιδίου σχετίζονται με κληρονομικές κακοήθειες. Όταν αφαιρεθεί η θέση δέσμευσης του CTCF, η έκφραση του Rb μειώνεται και οι όγκοι είναι σε θέση να ευδοκιμήσουν.^[2]Άλλα γονίδια που κωδικοποιούν τους ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου περιλαμβάνουν τα BRCA1 και p53, τα οποία είναι κατασταλτικά ανάπτυξης που αποσιωπούνται σε πολλούς τύπους καρκίνου και των οποίων η έκφραση ελέγχεται από το CTCF. Η απώλεια της λειτουργίας του CTCF σε αυτά τα γονίδια οδηγεί στη σίγαση του καταστολέα της ανάπτυξης και συμβάλλει στο σχηματισμό καρκίνου.^[2]Η ανώμαλη ενεργοποίηση των μονωτών μπορεί να ρυθμίσει την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων των μεταλλοπρωτεϊνασών θεμέλιας ουσίας που εμπλέκονται στην εισβολή καρκινικών κυττάρων.^[16]