Hores després de l'assassinat d'Enric IV el 1610, el Parlament de París la va confirmar com a regent. En aquest càrrec no fou gaire brillant i caigué ràpidament en la influència del seu favorit italià, Concino Concini. Amb la regent i el favorit els catòlics esperaven forçar la supressió del protestantisme a França.
El 1614 Maria patí la revolta dels principals nobles francesos, que volgueren aprofitar-se de la debilitat de la regent per aconseguir recuperar el poder que havien anant perdent (i que perdrien posteriorment del tot) amb l'ascens de la monarquia absolutista. Els Estats Generals hagueren de ser convocats per solucionar el conflicte, en l'última ocasió que hagueren de solucionar un conflicte abans de la Revolució francesa.
El 1617 el seu fill aconseguí la majoria d'edat i Maria de Mèdici fou exiliada i reclosa al castell de Blois. Aconseguí escapar-se'n el 1619 i s'alià amb el seu fill petit Gastó d'Orleans contra el rei. Derrotats finalment, aconseguí el perdó reial gràcies a la mediació del cardenal Richelieu. Finalment, aconseguí mantenir una cort a Angers, tot i que posteriorment viatjà fins a Amsterdam, Brussel·les i Colònia.
Maria de Mèdici morí a Colònia i fou enterrada a París a la catedral de Saint-Denis al costat del seu espòs.