Su mikrobiyolojisi

Atıksuların, temiz su kaynaklarını ve kıyı sularını kirletmesi, insani tüketim amaçlı sulara mikroorganizmaların ve dolayısıyla patojenlerin bulaşmasının en yaygın sebebidir ve genel olarak, sulardan kaynaklı en büyük mikrobiyal risk, hayvan veya insan dışkısı ile kontamine olmuş suyun tüketilmesi olarak kabul edilir.^[4]

Sularda bulunan patojenler çevresel patojenler ve enterik patojenler olarak 2 grupta incelenebilirler.^[5] Legionella spp., Pseudomonas aeruginosa, Nagleria fowleri gibi çevresel patojenler sürekli bu ortamlarda yaşayan, konak organizmaya ihtiyaç duymadan düşük besin ortamında çoğalabilen mikroorganizmalardır. Enterik patojenler ise genellikle enfekte konakların bağırsak sistemlerinde çoğalır ve suya fekal kontaminasyon yoluyla girerler, örneğin: Campylobacter, Salmonella, Cryptosporidium, Giardia ve enterovirüsler.^[5]

Poliovirüs

Coxsacki virüs A ve B

Hepatit A veE

Enterovirüs

Su sisteminde bulunan biyofilmler çevresel veya enterik kökenli tüm patojenler için tutunma, beslenme ve hayatta kalma ortamı sağlarlar.^[7][8] Biyofilmler, mikroorganizmaların bir yüzeye tutunarak oluşturdukları ve salgıladıkları ekstrasellüler polimerik bir matriks içinde bulundukları ortak yaşam alanlarıdır.^[9] Bu dış etmenlere kapalı ortak yaşam mikroorganizmalara daha fazla besin ve çevresel strese ve özellikle dezenfektanlara karşı koruma sağlamaktadır. Ayrıca biyofilm içerisinde çoğalan patojenlerin hastalık yapma ihtimallerinin daha fazla olduğu yönünde görüşler de mevcuttur.^[10]

Sularda patojen mikroorganizma varlığının araştırılması için yapılan analizlerdir. Bilinen tüm patojenler için test yapılması maliyet ve zaman açısından işlevsel değildir. Bu nedenle rutin analizlerde, belirlenmiş bazı indikatör mikroorganizmalar aranır ve elde edilen sonuçlarla suyun kirliliği hakkında bir yargıya ulaşılır.^[11]

İndikatör mikroorganizmalar

Suda analizi yapılan indikatör mikroorganizmalar 3 grupta incelenebilir.^[12]

Genel proses indikatörleri, dağıtım hattının genel işleyişi ve dezenfeksiyon durumu hakkında fikir veren göstergelerdir. Mesela toplam koloni sayımı ve total koliform analizi klorla dezenfeksiyon işleminin yeterliliği hakkında fikir verirler.^[12]

Toplam koloni sayımı veya diğer adıyla heterotrofik bakteri sayımı, organik besin maddeleri içeren bir ortamda, belli bir sıcaklık ve sürede üreyen tüm mikroorganizmaların sayılması anlamına gelmektedir.^[13] Yüksek olması tam anlamıyla bir kirlilik göstergesi olmasa da, su dağıtım sisteminin genel temizlik durumu ve bu durumdaki olası değişiklikler, yapılan dezenfeksiyon işleminin sudaki bakteri varlığına etkileri ve yeterliliği hakkında fikir verdiği düşünülmektedir.^[13]

Koliform bakteriler, Enterobacteriaceae familyasına üye pek çok cins ve türü kapsayan bir grubun genel adıdır ve en bilinen üyeleri Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Yersinia ve Hafnia’dır.^[14] Ortak özellikleri: aerobik veya fakültatif aerobik, Gram-negatif, spor oluşturmayan, çubuk şekilli, oksidaz negatif olmaları ve laktozu fermente edebilmeleridir.^[15] Fekal kaynaklı olabilecekleri gibi, çevresel ortamdan kaynaklı da olabilirler. Çoğu patojen değildir. Su sistemlerinde tespit edilmeleri fekal kirlilik göstergesi sayılmaz. Ancak eğer sisteme koliformlar girebiliyor ve hayatta kalabiliyorsa, bu durum patojenlerin bakterilerin de girebileceği bir kontaminasyon kaynağının var olduğunu ve dezenfeksiyonun yetersiz olduğunu gösterir.^[16]Fekal kontaminasyon indikatörleri, insan ve sıcakkanlı hayvan dışkısı kökenli bakterilerin sularda bulunması fekal bir kontaminasyonu gösterir ve patojen mikroorganizmaların da büyük ihtimalle bulunabileceğine işaret eder.^[12]En yaygın kullanılan fekal indikatör E.coli’dir. Koliform grubuna ait, gram (-) negatif, laktozu fermente eden ve tüm sıcakkanlı hayvan dışkılarında bulunan bir bakteridir. Su analizlerinde indikatör olarak tercih edilmesinin sebepleri:^[17]

• Tüm memelilerin dışkılarında çok yüksek miktarlarda bulunur.
• Konak canlılar olmadan, doğada nadiren çoğalabilir.
• Tespit metotları ucuz, basit, hassas ve duyarlıdır.
• İçme suyu dağıtım hatlarında hayatta kalma süresi, rutin bir numune alma programı ile tespit edilebilmesi için yeterlidir.
• E.coli için düzenli olarak analiz yapılması, sistemin düşük maliyetle, etkin bir şekilde işletilerek, halk sağlığının korunması düzeyinin arttırılmasını sağlar.

Diğer yaygın kullanılan fekal indikatörler, Fekal Streptokoklar ve Clostridium perfringens’tir.

Fekal streptokoklar veya diğer adıyla enterokoklar gram (+), kok şeklinde bakterilerdir. En yaygın türleri Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis'tir.^[18] Su ortamına ve özellikle tuzlu sulara koliformlara ve E.coli’ye nispeten daha dayanıklıdırlar. Bu açıdan fekal virüslerle paralellik gösterirler.  Özellikle yüzme sularında indikatör olarak kullanılırlar.^[18]

C.perfringens, gram (+), anaerob, sporlu bir bakteri türüdür. İndikatör olarak tercih edilmesindeki başlıca etken, spor oluşturması sayesinde çevresel şartlara ve biyosidlere dayanıklılığının fazla olması ve sularda diğer bakterilerden çok daha uzun süre hayatta kalabilmesidir.^[19][20] Ancak memeli hayvan bağırsaklarında bulunma oranı E.coli ve Enterokoklara göre daha düşüktür, bu nedenle fekal indikatör olarak etkinliği tartışmalıdır.^[12][21]

Model organizmalar, patojenlere varlıkları veya hareket tarzlarındaki benzerlikleri yönünden gösterge olarak kullanılan mikroorganizma gruplarıdır. Örneğin E.coli, Salmonella türleri için bir belirteç ve model olarak kabul edilmektedir.^[12]

Analiz Yöntemleri

Sularda mikroorganizmalarının tespit edilmesi ve yoğunluklarının belirlenmesi için çeşitli analiz yöntemleri mevcuttur. Bu yöntemleri öncelikle mikrobiyolojik kültür ve moleküler yöntemler olarak iki gruba ayırarak incelemek mümkündür. Mikrobiyolojik kültür, mikroorganizmaların laboratuvar ortamında, kontrollü şartlar altında ve belirli besin maddeleri içeren bir ortamda, gelişmelerinin ve üreyerek çoğalmalarının sağlanmasıdır. Moleküler analizde ise  DNA, RNA gibi nükleik asit molekülleri hedeflenerek mikroorganizmaların varlığı tespit edilir.

Kültür metotları daha zaman alıcı fakat maliyeti az iken, moleküler yöntemler tersine daha hızlı fakat yüksek maliyetlidir. Ayrıca kültür yöntemleri sadece üreme yeteneğine sahip canlı mikroorganizmaları tespit edebilirken, moleküler yöntemler ölü veya inaktif organizmalara ait genetik molekülleri de tespit edeceğinden, özellikle dezenfeksiyon işlemi sonrası alınan numuneler için tartışmalı sonuçlar elde edilebilir.^[22]  Bazı durumlarda birlikte kullanımları da söz konusu olabilir.

Mikrobiyolojik Kültür

Kültürü en kolay mikroorganizmalar bakteriler iken, virüs kültürü zor ve zaman alıcıdır. Rutin su analizlerinde mikrobiyolojik kültür yöntemleri indikatör bakteriler için kullanılmaktadır ve başlıca 3 analiz türü mevcuttur:

Dökme / yayma plak yöntemi:^[23] Toplam koloni sayımı için kullanılır. Belirli bir hacimdeki numunenin, maya ekstrakt agar gibi genel üretici tarzda agarlı bir besiyerine aşılama veya üzerine yayma ile aerobik inkübasyonu sonucunda oluşan kolonilerin sayılması yöntemidir. Üreyen mikroorganizmalara doğrulama testleri yapılmaz, tüm üreyen koloniler sayılır. Genellikle 1 mL numune ilave edilir ve inkübasyon sıcaklığı 36 °C ve 22 °C olarak seçilebilir. Yeraltı suyu kaynaklarının durumunu ve su arıtım işlemlerinin etkinliğini tayin etmek için yararlı bir yöntemdir ve sonuçlar su dağıtım sistemlerinin durumu ve temizliğinin göstergesi olarak da kullanılabilir.

Çoklu Tüp - En Muhtemel Sayı (EMS) Yöntemi:^[24] Sıvı besiyeri içeren tüplere, farklı konsantrasyon serilerinde 3’er tekrar numune ekimi yapılarak, üreme olan tüplerin sayılması yöntemidir. Üreme besiyerindeki bulanıklık değişimi, gaz oluşumu veya renk değişimi gibi kriterlerle belirlenir ve gerekirse doğrulama testleri uygulanır. Üreme tespit edilen konsantrasyonlar EMS istatistik tablosu ile karşılaştırılarak sonuçlar belirlenir. Mikroorganizma sayıları kesin değil, konsantrasyona dayalı tahminidir, bu nedenle EMS (En muhtemel sayı) şeklinde rapor edilir. Rutin su analizlerinde özellikle Total Koliform ve E.coli analizi için uzun yıllar kullanılmış, ancak günümüzde yerini membran filtrasyon yöntemine bırakmıştır. Filtre edilemeyecek kadar yoğun partiküllü ve bulanık sularda veya gıda analizlerinde kullanılmaktadır.

Membran Filtrasyon Yöntemi: Analiz edilecek su numunesinin, selülozik bir membran filtreden vakum pompası ile süzülmesine dayalı bir yöntemdir.^[25][26] Membran filtre genellikle 0.45 mikron çapında porlara sahiptir ve süzülen sudaki mikroorganizmalar bu porlardan geçemeyerek membranın üstünde kalırlar. Membran uygun bir agarlı besiyerine yerleştirilerek inkübe edilir ve gelişen koloniler sayılarak sonuç elde edilir.^[26][27] Gerekli ise kolonilere doğrulama testleri de yapılabilir. Üreyen her koloninin suda bulunan bir bakteriden veya bakteri kümesinden meydana geldiği kabul edilir ve bu nedenle sonuçlar koloni oluşturan birim (kob) cinsinden ifade edilir.^[25] Hedeflenen mikroorganizmaya uygun, farklı por çapına sahip filtreler kullanılabilir. Oluşan koloniler direkt sayılabildiği için EMS yöntemine göre daha hızlı ve kesin sonuç vermektedir. Ancak porların tıkanmasına ve yeterli suyun filtre edilememesine neden olacağından, çok fazla partikül ve askıda katı madde içeren, aşırı çamurlu ve bulanık sular için uygun bir yöntem değildir.^[25]

Moleküler metodlar

Rutin su analizlerinde moleküler metotlar pek kullanılmazlar. Bunun başlıca nedenleri kullanılan cihaz ve ekipmanların yaygın bulunmayışı ve yüksek maliyetli oluşudur. Moleküler metotlar nükleik asitlerin hibridizasyonu (çapraz eşleşme), restriksiyonu (kesme), amplifikasyonu (kopyalayarak çoğaltma) ve sekanslaması (dizilim) gibi teknikleri kullanırlar.^[22] En bilinen yöntem Polimeraz zincir reaksiyonudur (PCR).  Hedef mikroorganizmaya ait nükleik asit molekülünün DNA polimeraz enzimi ile amplifikasyonu prensibi ile çalışır.  Ayrıca Floresan in situ hibridizasyon (FISH), Revers trankriptaz PCR, Laser scanning, DNA çipleri gibi bazıları yeni ortaya çıkmış pek çok farklı metot mevcuttur.^[22]

Analiz Standartları

Analizlerin standartize edilmesi amacıyla TSEK, ISO, CEN gibi kuruluşların yaptığı çalışmalar neticesinde analiz standartları oluşturulmuştur. Türkiye'de en fazla kullanılan su mikrobiyolojisi analiz standartları şunlardır: