Western blot
Western blot, ponekad zvani i kao proteinski imunoblot ili western blotiranje, je široko upotrebljavana analitička tehnika u molekulskoj biologiji i imunogenetici za otkrivanje specifičnih proteina u uzorku homogenata ili ekstrakta tkiva.
Da bi postigla razdvajanje određenog proteina od kompleksa, western blot tehnika koristi tri elementa: razdvajanje po veličini, prijenos proteina na čvrsti nosač i obilježavanje ciljnog proteina pomoću primarnog i sekundarnog antitijela, za vizualizaciju. Stvara se sintetsko ili životinjsko antitijelo (poznato kao primarno antitijelo) koje prepoznaje i veže se za određenu metu proteina. Membrana za elektroforezu se opere u rastvoru koji sadrži primarno antitijelo, prije nego što se ispere višak antitijela. Dodaje se sekundarno antitijelo koje prepoznaje i veže se za primarno antitijelo. Sekundarno antitelo se vizualizira različitim metodima, kao što su bojenje, imunofluorescencija i radioaktivnost, omogućavajući indirektno otkrivanje specifičnog ciljnog proteina.
Ostale srodne tehnike uključuju dot blot analizu, kvantitativni tačkasti blot, imunohistohemijske i imunocitohemijske postupke, gdje se antitijela koriste za otkrivanje proteina u tkivima i ćelijama i enzimski imunski test (ELISA).
Naziv 'western blot' igra je na u poređenju sa Southern blot, tehnikom za otkrivanje DNK koja je nazvana po svom pronalazaču, engleskom biologu Edwinu Southernu. Slično tome, otkrivanje RNK naziva se Northern blot.[2] Termin "vestern blot" dao je W. Neal Burnette 1981. godine,[3] iako je sam metod nastao 1979. u laboratoriji Harryja Towbina na Institutu Friedrich Miescher u Baselu, Švicarska.[4] Između 1979. i 2019, spomenut je u naslovima, sažecima i ključnim riječima u više od 400 000 PubMed popisanih publikacija i još uvijek može biti najčešće korištena proteinsko-analitička tehnika.[5]
Primjena
Western blot se opsežno koristi u biohemiji za kvalitativno otkrivanje pojedinačnih proteina i njihovih modifikacija (kao što su posttranslacijske modifikacije). Procjenjuje se da najmanje 8-9% svih publikacija povezanih s proteinima primjenjuje Western blot.[5] Koristi se kao opći metod za identificiranje prisustva specifičnog pojedinačnog proteina u složenoj mješavini proteina. Polukvantitativna procjena proteina može se izvesti iz veličine i intenziteta boje proteinske trake na blot membrani. Pored toga, primjena serija razrjeđenja pročišćenog proteina poznatih koncentracija, može se koristiti da bi se omogućila preciznija procjena koncentracije proteina. Western blot se rutinski koristi za verifikaciju proizvodnje proteina nakon kloniranja. Također se koristi u medicinskoj dijagnostici, npr. u HIV-testu ili BSE.
Potvrđujući HIV test koristi Western blot za otkrivanje antitijela na HIV u uzorku seruma. Proteini iz poznatih HIV-zaraženih ćelija odvajaju se i upijaju na membranu kao što je gore opisano. Zatim se serum koji se testira nanosi u koraku primarne inkubacije antitijela; slobodno antitijelo se ispere, a doda se sekundarno anti-ljudsko antitijelo povezano sa enzimskim signalom. Obojene trake tada ukazuju na proteine na koje pacijentov serum sadrži antitijela.[6]
Western blot se takođe koristi kao konačni test za varijantnu Creutzfeldt-Jakobove bolesti, tipa prionske bolesti povezane sa konzumacijom kontaminirane govedine od goveda sa goveđom spongiformnom encefalopatijom (BSE, obično se naziva i 'bolest ludih krava').[7]
Ostala područja primjene su u dijagnozi tularemije. Procjena sposobnosti Western blot-a da detektira antitijela protiv F. tularensis otkrila je da je njegova osjetljivost gotovo 100%, a specifičnost 99,6%.[8]
Neki oblici testiranja na lajmsku bolest koriste Western bloting.[9] A western blot can also be used as a confirmatory test for Hepatitis B infection and HSV-2 (Herpes Type 2) infection.[10][11] U veterinarskoj medicini se Western blot ponekad koristi za potvrđivanje FIV + statusa kod mačaka.[12]
Daljnja primjena Western blot tehnike uključuju upotrebu Svjetske antidoping agencije (WADA). Doping krvi je zloupotreba određenih tehnika i / ili supstanci za povećanje nečije mase crvenih krvnih zrnaca, što omogućava tijelu da transportuje više kisika u mišiće i time povećava izdržljivost i performanse. Postoje tri široko poznate supstance ili metode koje se koriste za doping krvi, a to su eritropoetin (EPO), sintetski nosači kisika i transfuzija krvi. Svaka je zabranjena WADA-inom listom zabranjenih supstanci i metoda. Western blot tehnika korištena je tokom FIFA-inog svjetskog kupa 2014. u antidoping kampanji za taj događaj.[13] Ukupno je preko Reichela i saradnika [14] sakupljeno i analizirano preko 1.000 uzoraka u WADA akreditovanoj laboratoriji u Lozani, Švicarska.Nedavna istraživanja koja koriste Western blot tehniku pokazala su poboljšanu detekciju EPO u krvi i urinu na osnovu novih Velum SAR sklopnih horizontalnih gelova, optimizovanih za rutinsku analizu.[15] Usvajanjem horizontalne SAR-PAGE u kombinaciji sa Velum SAR gelovima koji su podržani od gotovog filma, diskriminacijski kapacitet primjene mikro-doze rEPO je značajno pojačan.
Također pogledajte
- Far-western blot
- Eastern blot
- Northwestern blot
- Brza paralelna proteoliza
References
Vanjski linkovi
- Yang, Ping-Chang; Mahmood, Tahrin (2012). "Western blot: Technique, theory, and trouble shooting". North American Journal of Medical Sciences. 4 (9): 429. doi:10.4103/1947-2714.100998. ISSN 1947-2714. PMC 3456489. PMID 23050259.
- "Western Blotting". YouTube. Bio-Rad Laboratories. 16. 10. 2012.
- "Blotting Techniques/ The Principle of Western Blotting". YouTube. Biomedical and Biological Sciences. 23. 3. 2017.
Šablon:Proteinski methodiŠablon:Molekularne sonde
