Участник:Sirozha/Киназы

По рациональной номенклатуре киназы (фосфотрансферазы) относятся к группе EC 2.7

2.7.1 Акцептор — гидроксильная группа OH

Представители: Гексокиназа, глюкокиназа, галактокиназа, фосфофруктокиназа, тимидинкиназа, глицеролкиназа, мевалонаткиназа, пируваткиназа, диацилглицеролкиназа, фосфатидилинозитолкиназа, сфингозинкиназа.

2.7.2 Акцептор — карбоксильная группа COOH

Представители: фосфоглицераткиназа, аспартаткиназа.

2.7.3 Акцептор — азот N

Представитель: креатинкиназа.

2.7.4 Акцпетор — ортофосфат PO₄^3-

Представители: фосфомевалонат, аденилат, нуклеозиддифосфат — киназы.2.7.6 Акцпетор — пирофосфат P₂O₇^2-

Представители: Рибозофосфатдифосфокиназа, тиаминпирофосфокиназа.

2.7.7 Нуклеотидилтрансферазы

Представители: интеграза, полимеразы, концевая дезоксинуклеотидил трансфераза, РНК репликаза, обратная транскриптаза, теломераза, транспозаза.

2.7.8 Другие фосфотрансферазы

Представители: N-ацетилглюкозамин-1-фосфат трансфераза.

2.7.10 Тирозиновые протеинкиназы.

2.7.11 Серин-треониновые протеинкиназы.

Тирозиновые киназы это ферменты, которые переносят фосфатную группу от АТФ на остаток аминокислоты тирозин в белке. Фосфорилирование белков киназами является важным механизмом в регуляции активности ферментов при сигнальной трансдукции.^[3]

Большинство тирозиновых киназ имеют сопряженные тирозинфосфатазы.

Тирозиновые киназы классифицируют на две группы: цитоплазматические и трансмембранные (связанные с рецептором).

Цитоплазматические протеинкиназы

Геном человека содержит 32 гена цитоплазматических тирозиновых протеинкиназ (2.7.10.2). Первым изученным геном тирозинкиназы, не связанной с рецептором, был ген из семейства Src, прото-онкогенных тирозиновых киназ. Киназы этого семейства содержатся почти во всех клетках животных. Было показано, что вирус саркомы Рауса (RSV) содержит мутантную копию нормального клеточного гена Src. Белки семейства Src регулируют многие клеточные процессы, они участвуют в передаче интегрин-зависимых сигналов в клетку, которые побуждают ее деление. Геном ретровирусов (в том числе и вируса саркомы Рауса) может содержать ген v-src (viral-sarcoma), который является онкогеном, он не содержит С-концевого участка, ингибирования фосфорилирования, и поэтому постоянно активен в клетке, чем отличается от c-src (клеточного гена), которые активируется только некоторыми внешними сигналами (например, факторами роста), и является протоонкогеном.

TCR (T-cell receptor, рецептор антигена Т-лимфоцитов), передает сигнал внутрь клетки путем активирования двух белков Lck и Fyn, относящихся к семейству Src. Этот сигнал приводит к пролиферации Т-лимфоцитов и усилению клеточного иммунитета.

Рецепторы, связанные с тирозинкиназами

Геном человека содержит 58 генов тирозиновых киназ,^[4] связанных с рецепторами (2.7.10.1). Гормоны и факторы роста, которые взаимодействуют на поверхности клетки с рецепторами, связанными с тирозиновыми киназами, как правило, вызывают рост клеток и стимулируют клеточные деления (например, инсулин, инсулин-подобный фактор роста 1, эпидермальный фактор роста). Рецепторы, связанные с тирозиновыми киназами это высокоаффинные рецепторы на поверхности клеток, связывающие полипептидные факторы роста, цитокины и гормоны. Такие рецепторы не только регулируют клеточные процессы, но и играют критическую роль в развитии многих видов рака.^[5]

Рецепторы с тирозинкиназной активностью классифицируют на двадцать семейств (эпителиального фактора роста, инсулина, фактора роста тромбоцитов и других). Большинство рецепторов имеют только одну субъединицу, в то время как инсулиновый рецептор является мультимерным комплексом.

Структура рецептора

Каждый мономер имеет один трансмембранный домен, состоящий из 25-38 аминокислотных остатков, внеклеточный N-концевой домен и внутриклеточный C-концевой домен. Внеклеточный домен очень крупный и отвечает за связывание лигандов (факторов роста или гормонов), внутриклеточный участок содержит домены с киназной активностью.

Работа рецептора

Когда фактор роста или гормон соединяется с внеклеточным доменом рецептора тирозинкиназы, последний димеризуется и включает соседние молекулы рецепторов. Димеризация быстро активирует цитоплазматические домены, первым субстратом которых является собственно рецептор, в результате чего рецептор самофосфорилируется по многим специфичным внутриклеточным остаткам.

Передача сигнала

Тирозиновые протеинкиназы принимают участие в передаче сигнала в клетке путем фосфорилирования специфических остатков тирозина. Активированный рецептор создает сайты связывания белков, имеющих SH2 домены или домены связывания фосфотирозина (PTB).^[6] Специфические белки, содержащие такие домены (Src, фосфолипаза Сγ), соединяются с рецептором и фосфорилируются внутриклеточным доменом, что активирует эти белки и ведет к инициации путей сигнальной трансдукции.^[6] Другие белки, которые взаимодействуют с активированным рецептором, могут выполнять адаптерные функции и не обладают собственными ферментативными активностями. Такие адаптерные белки связывают рецепторы тирозиновых протеинкиназ с нижележащими путями сигнальной трансдукции, например, с каскадом МАР-киназ.

Серин-треониновые протеинкиназы (2.7.11.1) фосфоририруют гидроксильную группу в остатках серина или треонина.

Активность этих протеинкиназ регулируется несколькими событиями (например, повреждениями ДНК), а также некоторыми химическими сигналами, в том числе, cAMP, cGMP, диацилглицеролом, Ca²⁺кальмодулином.

Серин/треониновые протеинкиназы фосфорилируют остатки серина или треонина в консенсусных последовательностях, которые образуют фосфоакцепторный сайт. Эта последовательность остатков аминокислот в молекуле субстрата, позволяет осуществлять контакт каталитической щели протеинкиназы с фосфорилируемой областью. Эта особенность делает киназу специфичной не к какому-либо определенному субстрату, но к специфичному семейству белков с одинаковыми консенсусными последовательностями.В то время, как каталитические домены этих протеинкиназ высококонсервативны, последовательности узнавания отличаются, обуславливая узнавание разных субстратов.

Киназа фосфорилазы

Киназа фосфорилазы (2.7.11.19) была первым ферментом семейства серин/треониновых протеинкиназ, открытым Кребсом в 1959 году. Киназа фосфорилазы превращает неактивную гликогенфосфорилазу В в активную форму гликоген-фосфорилазу A, последняя отщепляет от гликогена остатки глюкозо-1-фосфата. Киназа фосфорилазы активируется протеинкиназой А.

Протеинкиназа А

Протеинкиназа А, или цАМФ-зависимая протеинкиназа, (2.7.11.1) относится к семейству ферментов, активность которых зависит от уровня циклического АМФ (цАМФ) в клетке. Протеинкиназа А является самой изученной из всех протеинкиназ, ее функции разнообразны, она участвует в регуляции метаболизма гликогена, липидов и сахаров, ее субстратами могут быть другие протеинкиназы или другие метаболические ферменты.

Протеинкиназа А участвует в цАМФ-стимулируемой транскрипции генов, которые имеют цАМФ-реактивный элемент в регуляторном участке. Повышение концентрации цАМФ ведет к активации протеинкиназы А, которая фосфорилирует транскрипционный фактор CREB по остатку серина 133, CREB связывает своим фосфорилированным участком коактиватор транскрипции и стимулирует транскрипцию.

Молекула протеинкиназы А является холоферментом (то есть требует кофермент для работы) и в неактивном состоянии является тетрамером — состоит из двух регуляторных и двух каталитических субъединиц. Если уровень цАМФ в клетке низкий, холофермент остается интактным и каталитическая активность отсутствует. Когда концентрация цАМФ в клетке возрастает (если активируется аденилатциклаза рецепторами, связанными с G-белками, или ингибируются фосфодиэстеразы, расщепляющие цАМФ), цАМФ связывается с двумя сайтами связывания на регуляторных субъединицах, происходят конформационные изменения, диссоциация тетрамера на два каталитически активных димера (состоящих из одной каталитической и одной регуляторной субъединицы).

Открытые активные центры каталитических субъединиц переносят концевой фосфат молекулы АТФ на остатки серина или треонина. Протеинкиназы А представлены в многих типах клеток, и проявляют каталитические активности в отношении разных субстратов, поэтому, работа протеинкиназы А и концентрация цАМФ регулируется в разных биохимических путях. Следует отметить, что действие протеинкиназы А, вызванное фосфорилированием, как правило, кратковременное, так как протеинфосфатазы, сопряженные с киназами, быстро дефосфорилирует мишени.

Гормоны инсулин и глюкагон влияют на работу протеинкиназы А, изменяя уровень цАМФ в клетке по механизму активации рецепторов, связанных с G-белками (инсулин действует через тирозинкиназу), через аденилатциклазу. Инсулин активирует аденилатциклазу, повышая концентрацию цАМФ, протеинкиназа А фосфорилирует ферменты ацетил-КоА-карбоксилазу и пируватдегидрогеназу, направляя таким образом ацетил-КоА для синтеза липидов; глюкагон имеет противоположный эффект.

Работа протеинкиназы А регулируется и по механизму отрицательной обратной связи. Одним из субстратов, активируемых протеинкиназой А, является фосфодиэстераза, которая превращает цАМФ в АМФ, таким образом, снижая концентрацию цАМФ и ингибируя протеинкиназу А.

Протеинкиназа B

Протеинкиназа В или АКТ. Геном человека содержит семейство генов Akt1, Akt2, Akt3. Akt1 ингибирует процессы апоптоза, принимая участие в клеточных циклах, также Akt1 индуцирует синтез белка, и поэтому является ключевым белком в биохимических путях развития мышечной гипертрофии и роста тканей. Поскольку продукт гена Akt1 блокирует апоптоз и обеспечивает выживание клетки, Akt1 является одним из главных факторов в развитие многих видов рака. Первоначально Akt1 был выделен как онкоген в трансформирующем ретровирусе AKT8 в 1990 году.

Продукт гена Akt2 является важной сигнальной молекулой в пути передачи сигнала молекулой инсулина, этот белок требуется для включения транспорта глюкозы.

Роль Akt3 менее ясна, хотя показано, что этот ген преимущественно экспрессируется в мозге. Сообщается также, что мыши, лишенные Akt3, имеют маленький мозг.Были проведены исследования на мышах, имеющих нокауты по генам Akt1 или Akt2: мыши, с удаленным Akt1, но нормальным Akt2 имели меньший размер, но гомеостаз глюкозы был в норме, что определило роль Akt1 в процессах роста.

Для мышей без Akt2, но с нормальным Akt1, была характерна некоторая недостаточность роста, и они имели фенотипические проявления инсулин зависимого диабета, что показало значение Akt2 в проведении сигнала от инсулинового рецептора.

Регуляция и функции Akt

Регуляция активности Akt осуществляется путем связывания фосфолипидов в мембране. Akt содержит PH-домен (Pleckstrin Homology domain, порядка 120 остатков аминокислот), который высокоаффинно связывает фосфатидилинозитол-трифосфат (PIP3, ФИФ3) или фосфатидилинозитол-дифосфат (PIP2, ФИФ3). PH-домены выполняют функции заякоривания в мембранах, при этом фосфолипиды мембран служат связывающими субстратами. PIP2 может быть фосфорилирован только PIP3-киназами, и только в случае, если клетка получила сигнал к росту. PIP3-киназы могут быть активированы рецепторами, связанными с G-белками или рецепторами с тирозинкиназной активностью (например, инсулиновым рецептором). После активации, PIP3- киназы фосфорилируют PIP2 в PIP3.

После закрепления в мембране путем связывания с PIP3, Akt может быть активирована путем фосфорилирования фосфоинозитол-зависимыми киназами (PDK1 и PDK2, mTORC2). PDK1 фосфорилирует Akt, а mTORC2 стимулирует фосфорилирование PDK1. Активированная киназа Akt далее регулирует фосфорилированием активность многих субстратов. Akt может быть активирована и без участия PIP3-киназ.

Исследования показали, что агенты, повышающие концентрацию цАМФ могут активировать Akt через протеинкиназу А, хотя механизм такой активации пока не выяснен. Фосфатазы липидов контролируют концентрацию PIP3. Опухолевый супрессор PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten) работает как фосфатаза, и дефосфорилирует PIP3 в PIP2. Akt уходит от плазматической мембраны и ее активность значительно падает. Протеинфосфатазы контролируют количество фосфорилированного Akt. Фосфатазы PHLPP (PH domain and leucine rich repeat protein phosphatase) дефосфорилируют серин 473 в Akt и тем самым инактивируют ее.

Akt регулирует многие процессы, направленные на выживание клетки. Например, Akt может фосфорилировать про-апоптотический белок BAD (из семейства Bcl-2) по остатку серина 136, что вызывает диссоциацию BAD из Bcl-2/Bcl-X комплекса, и тот теряет свою про-апоптотическую функцию. Также Akt активирует транскрипционный фактор NF-κB (nuclear factor-kappa B), и включает транскрипцию генов выживания.

Akt требуется для инсулин-индуцируемой транслокации транспортера глюкозы 4 (GLUT 4) в плазматическую мембрану. Киназа-3 гликогенсинтетазы (GSK 3) может быть ингибирована фосфорилированием Akt, что вызывает синтез гликогена.

Akt1 также связана с ростом сосудов и развитием опухолей. Недостаточность Akt1 у мышей ингибирует физиологический ангиогенез, но усиливает патологический рост сосудов и опухолей.

Протеинкиназа С

Протеинкиназа С (PKC, EC 2.7.11.13) это семейство протеинкиназ, содержащее порядка десяти изоферментов, которые классифицируют по вторичным посредникам на три семейства: традиционные, или классические (conventional), оригинальные (novel), или нестандартные и нетипичные (atypical). Традиционные протеинкиназы С бывают α, βI, βII, γ изоформ, они требуют Ca²⁺, диацилглицерол или фосфатидилхолин (фосфолипиды) для активации.

Оригинальные активируются с помощью диацилглицерола, но не требуют Ca²⁺. Так что традиционные и оригинальные протеинкиназы С активируются через сходные пути сигнальной трансдукции, например, через фосфолипазу С. С другой стороны, нетипичные изоформы, не требуют ни Ca²⁺, ни диацилглицерола для активации. Поэтому термин протеинкиназа С, как правило, применяют для обозначения целого семейства изоформ.

Структура и регуляция

Все протеинкиназы С состоят из регуляторного и каталитического доменов, связанных шарнирной областью. Каталитические районы высоко консервативны между разными изоформами, но значительно отличаются от каталитических районов других серин-треониновых протеинкиназ. Различия в регуляторных районах обуславливают различия во вторичных посредниках между изоформами.Регуляторный домен на N-конце протеинкиназы С содержит отдельные участки. С1 домен, представленный во всех изоформах протеин киназы С, имеет сайт связывания диацилглицерола. С2 домен воспринимает ион Ca²⁺. Район псевдосвязывания субстрата представляет собой короткую последовательность аминокислот, которые подражают субстрату и занимают участок связывания субстрата в активном центре, делая фермент неактивным.

Когда Ca²⁺ и диацилглицерол (DAG) находятся в достаточных концентрациях, они связываются с доменами С2 и С1, соответственно, и вызывают прикрепление протеинкиназы С к мембране. Взаимодействие с мембраной вызывает освобождение псевдосубстрата от каталитического центра и активирует фермент. Таким образом, для осуществления таких аллостерических взаимодействий, протеинкиназа С должна быть определенным образом свернута, что происходит после фосфорилирования каталитического района.

Протеинкиназа С должна быть предварительно фосфорилирована для осуществления собственной киназной активности. Молекула протеинкиназы С содержит несколько сайтов фосфорилирования 3-фосфоинозитол-зависимой протеин киназы-1 (PDK 1). После активации протеинкиназа С переносится к плазматической мембране и присоединяются к RACK-белкам (Receptor for Activated C-Kinase), аминокислотная последовательность которых на 47 % гомологична бета-субъединицам G-белков.

Для протеинкиназ С характерен длительный период активности, которая сохраняется, даже если первоначальный сигнал или Ca²⁺ пропал. Это достигается образованием диацилглицерола из фосфатидилхолина с помощью фосфолипазы, либо с помощью жирных кислот

Субстраты

Консенсусная последовательность протеинкиназы С сходна с таковой для протеинкиназы А, и содержит остатки основных аминокислот вблизи остатков серина и треонина, подвергающихся фосфорилированию. Субстратами протеинкиназы С являются следующие белки: MAP-киназы, Raf-киназы, MARCKS (myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, производные миристоленовой кислоты, богатые аланином, субстраты протеинкиназы С) играют важную роль в поддержании формы клеток, способности к движению, секреции, трансмембранному транспорту, регуляции клеточного цикла. Как было недавно показано, MARCKS вовлечены в процессы экзоцитоза некоторых секреторных пузырьков, содержащих, муцин и хромафин. MARCKS — это кислые белки, которые содержат большое количество остатков аланина, глицина, пролина и глутаминовой кислоты. Они связаны N-концом с липидами мембраны (через миристоленовую кислоту), регулируются Ca²⁺, кальмодулином, протеинкиназой С.

VDR (Vitamin D receptor) — кальцитриоловый рецептор. Рецептор стероидных гормонов из семейства ядерных рецепторов. После активирования молекулой витамина D, образует гетеродимер с ретиноидным-Х-рецептором и связывается с регуляторными элементами на ДНК, изменяя экспрессию генов или снимая репрессоры генов. Глюкокортикоиды снижают экспрессию VDR во всех тканях.

Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) — относится к семейству рецепторов факторов роста, связывающих внеклеточные белковые лиганды, обладает тирозинкиназными активностями. Мутации, затрагивающие EGRF часто могут проявляться в раковом перерождении клетки. После связывания лиганда, рецептор димеризуется, происходит самофосфорилирование по пяти остаткам тирозина на С-конце рецептора, и EGRF приобретает внутриклеточную тирозинкиназную активность.^[7]

Последующая активность EGRF связана с инициацией каскада сигнальной трансдукции, активируются MAPK, Akt, JNK — что приводит к синтезу ДНК и пролиферации. Киназный домен также может фосфорилировать другие рецепторы, связанные с EGRF по остаткам тирозина.

Ca2+/кальмодулин — зависимые протеинкиназы

Са2+/кальмодулин — зависимые киназы, или СаМ киназы, ЕС 2.7.11.17 регулируются Са2+/кальмодулиновым комплексом. СаМ киназы классифицируют на два класса: специализированные СаМ киназы (например, киназа легких цепей миозина, которая фосфорилирует молекулы миозина, вызывая мышечное сокращение) и многофункциональные СаМ киназы (играют роль во многих процессах, секреции нейромедиаторов, регуляции транскрипционных факторов, в метаболизме гликогена), порядка 2 % белков головного мозга представлены СаМ второго типа.

Кальмодулин (СаМ) это вездесущий, кальций-связывающий белок, который связывается и регулирует активность многих других белков. Это маленький кислый белок, состоит из 148 аминокислотных остатков, содержит четыре домена связывания кальция.

СаМ служит промежуточным звеном в воспалении, апоптозе, мышечных сокращениях, развитии кратковременной и длительной памяти, росте нервов и иммунном ответе. Кальмодулин экспрессируется во многих типах клеток и находится в цитоплазме, внутри органелл, а также находится в плазматической мембране и мембранах органелл. Многие белки, которые связываются с кальмодулином, не могут сами связывать кальций, и используют кальмодулин как «датчик» кальция и компонент системы сигнальной трансдукции.

Кальмодулин также используется для запасания Ca²⁺ в эндоплазматическом и саркоплазматических ретикулюмах. После связывания кальция, молекула кальмодулина претерпевает конформационные изменения, что позволяет молекуле связывать другие белки для осуществления специфического ответа. Молекула кальмодулина может связать до четырех ионов кальция, может подвергаться посттрансляционной модификации, например, фосфорилированию, ацетилированию, метилированию, протеолизу, причем эти модификации могут модулировать активность СаМ.

Киназа легких цепей миозина. Киназа легких цепей миозина (MLCK) фосфорилирует миозин. Киназа легких цепей миозина имеет ключевое значение в сокращении гладкой мускулатуры. Сокращение гладких мышц может произойти после повышения концентрации кальция в результате притока из саркоплазматического ретикулюма или из внеклеточного пространства. Сперва кальций связывается с кальмодулином, это связывание активирует киназу легких цепей миозина, которая фосфорилирует легкие цепи молекул миозина. Фосфорилирование позволяет молекулам миозина образовывать поперечные мостики и связываться с актиновыми филаментами и стимулирует мышечное сокращение. Данный путь является основным в механизме сокращения гладких мышц, так как гладкие мышцы не содержат тропонинового комплекса, в отличие от поперечно-полосатых.

МАР-киназы

Митоген-активируемые киназы, ЕС 2.7.11.24, отвечают на внеклеточные стимулы (митогены) и регулируют многие клеточные процессы (экспрессию генов, деление, дифференцировку и апоптоз).МАРК вовлечены в работу многих неядерных онкогенов. Внеклеточные стимулы ведут к активации МАРК через сигнальный каскад, который состоит из МАРК, МАРКК (МАР2К) и МАРККК (МАР3К). МАР3К активируется внеклеточными стимулами и фосфорилирует МАР2К, затем МАР2К фосфорилированием активирует МАРК. Такой сигнальный МАР каскад консервативен от дрожжей до млекопитающих.

MAPK/ERK-путь

Это путь сигнальной трансдукции. ERK — или классические МАР-киназы, регулируются внеклеточными сигналами.

Рецепторы, связанные с тирозиновыми киназами (например, EGFR), активируются внеклеточными лигандами. Связывание EGF с рецептором активирует киназную активность цитоплазматического домена, который фосфорилирует EGFR. Белок GRB2, содержащий SH2 домен, связывается с остатками фосфотирозина. GRB2 своим SH3 доменом связывается с SOS (гуанин-нуклеотид заменяющим фактором), что активирует SOS. Активированный SOS убирает ГДФ от белка Ras, который может связать ГТФ и стать активным. Другие малые G-белки активируются подобным путем.

Активный Ras активирует RAF-киназу (серин-треониновой специфичности). RAF-киназа фосфорилирует и активирует МЕК, другую серин-треониновую киназу. МЕК фосфорилирует и активирует МАРК. Эта серия киназ от RAF к МЕК и к МАРК является примером протеинкиназного каскада.

Один из эффектов активации МАРК это изменение трансляции мРНК. МАРК фосфорилирует и активирует S6 киназу 40S рибосомных белков (RSK), которая фосфорилирует рибосомный белок S6, который отделяется от рибосомы.

МАРК регулирует активности нескольких транскрипционных факторов, например, C-myc. Изменяя концентрации и активности транскрипционных факторов, МАРК изменяет активности генов, регулирующих клеточный цикл.

Гистидиновые киназы найдены в прокариотах и по своей структуре отличаются от других известных протеинкиназ. В прокариотах гистидин-специфичные протеинкиназы работают как часть двухкомпонентной системы сигнальной трансдукции. Фосфатная группа отщепляется от АТФ и сначала присоединяется к собственному остатку гистидина, а затем переносится на остаток аминокислоты аспартат другого (целевого) белка, или иногда на собственный аспартат протеинкиназы. Фосфорилированный аспартат далее активен в передаче сигнала.

Гистидиновые киназы широко распространены в прокариотах, а также в растениях и грибах. Фермент пируватдегидрогеназа животных, относящийся к семейству киназ, структурно повторяет гистидиновые киназы, но фосфорилирует остатки серина, и, возможно, не использует гистидин-фосфатный интермедиат.

1. Gomperts, Tatham, Kramer. Signal transduction. — London: Elsevier Science, 2003. — 424 с. — ISBN 01-12-289631-9.