Hemijska ligacija
Hemijska ligacija je set tehnika koje se koriste za stvaranje dugačkih peptidnih ili proteinskih lanaca. To je drugi stepen u konvergentnom pristupu. Prvo se manji peptidi sa 30-50 aminokiselina pripreme konvencionalnom hemijskom sintezom peptida[1]. Oni su potpuno nezaštićeni. Hemijska ligacija je tehnika povezivanja tih peptida putem hemoselektivnih reakcija da bi se dobio jedinstven proizvod, obično u vodenom rastvoru. Sa nekoliko uzastopnih povezivanja, proteini do 200-300 aminokiselina se mogu proizvesti.
Metodi hemijske ligacije
Više tehnika je opisano u literaturi.[2] Najpraktičniji i najrobustniji metod za hemoselektivne reakcije nezaštićenih peptida je prirodna hemijska ligacija.[3][4] Prirodna hemijska ligacija je prevazišla limitacije klasičnog sintetičkog organsko hemijskog pristupa totalnoj sintezi proteina, i omogućava rutinsku totalnu ili semi- sintezu proteinskih molekula. Originalni hemijsko ligacioni metodi su formirali non-nativne veze na mestu ligacije.[5] Nativna hemijska ligacija je bila naknadno razvijena. U nativnoj hemijskoj ligaciji, nezaštićeni peptid-tioestar reaguje sa Cys-peptidom da proizvede ligacioni proizvod sa prirodnom peptidnom vezom na mestu ligacije. U tom metodu, inicijalni tioestar-vezani ligacioni intermedijar se reorganizuje da formira amidnu vezu.
Nativna hemijska ligacija oslanja na prisustvo ostataka cisteina na mestu ligacije. Metodi koji koriste zaštitne pomoćne grupe mogu u nekim slučajevima da prošire opseg upotrebe nativne hemijske ligacije na non-cisteinske ostatke, kao što može i upotreba desulfurizacije nakon ligacije (npr. konvertovanje Cys u Ala).
Izražena proteinska ligacija
Korišćenjem prirodnog inteina moguće je pripremiti rekombinantni polipeptid C-terminalni tioestar. Ovo omogućava upotrebu velikih rekombinantnih proteina – izvedenih iz tioestera u nativnoj hemijskoj ligaciji.[6] Rekombinantni tioestar može biti spojen u a sintetički peptid sa N-terminalnim cisteinom. Nativna hemijska ligacija ove vrste koristeći rekombinantne C-terminalne tioestere je poznata kao izražena proteinska ligacija. Rekombinantna ekspresija takođe biti korišćena da proizvede Cys-polipeptid za upotrebu u nativnoj hemijskoj ligaciji.