Mycoplasma laboratorium

Виготовлення Synthia є замислом у галузі синтетичної біології, реалізованим в Інституті Дж. Крейга Вентера групою з приблизно 20 вчених на чолі з Нобелівським лауреатом Гемілтоном Смітом, яка містила також дослідника ДНК Крейга Вентера та мікробіолога Клайда А. Гатчісона III. Загальною метою є зведення живого організму до найнеобхіднішого в ньому і, таким чином, з'ясування того, що потрібно для побудови нового організму з нуля^{[a 3]}. Спершу увага була зосереджена на бактерії M. genitalium, облігатному внутрішньоклітинному паразиті, геном якого містить 482 гени, які утворені 582970 пар основ, розташованих в одній кільцевій хромосомі (на момент початку проєкту це був найменший геном серед усіх відомих у природних організмів, які можна вирощувати у культурі вільних клітин). Вони використовували транспозоновий мутагенез, щоб визначити гени, які не були необхідними для росту організму, що призвело до виявлення мінімального набору з 382 генів^{[a 3]}. Цей замисел відомий як проєкт мінімального геному^{[a 5]}.

Мікоплазма

Mycoplasma — рід бактерій класу Mollicutes у відділі Tenericutes, що характеризується відсутністю клітинної стінки (що робить її грам-негативною) через паразитичний або коменсальний спосіб життя. У молекулярній біології цьому роду приділяють багато уваги як через те, що він є сумнозвісним важко викорінюваним забруднювачем у культурах клітин ссавців (він несприйнятливий до бета-лактамних та інших антибіотиків)^{[a 6]}, так і через можливість потенційного використання його як модельного організму через невеликий розмір його геному^{[a 7]}. Вибір роду для проєкту Synthia датується 2000-м роком, коли Карл Райх придумав фразу Mycoplasma laboratorium^{[a 2]}.

Інші організми з малими геномами

Станом на 2005 рік, Pelagibacter ubique (α-протеобактерія порядку Rickettsiales) мав найменший відомий геном (1 308 759 пар основ) серед будь-яких вільних живих організмів і є однією з найменших відомих самовідтворювальних клітин. Це, мабуть, найчисленніша бактерія у світі (можливо 10²⁸ окремих клітин) і, за оцінками, разом з іншими членами клади SAR11, вони складають від чверті до половини всіх бактеріальних або археальних клітин в океані^{[a 8]}. Вона була ідентифікована у 2002 році за послідовностями рРНК і була повністю секвенована у 2005 році^{[a 9]}. Надзвичайно важко вирощувати види, які не досягають високої щільності росту в лабораторній культурі^{[a 10][a 11]}. Кілька нещодавно відкритих видів мають менше генів, ніж M. genitalium, але не є вільноживучими: багато важливих генів, яких немає у Hodgkinia cicadicola, Sulcia muelleri, Baumannia cicadellinicola (симбіонти цикад) та Carsonella ruddi (симбіонт листоблішки Pachypsylla venusta^{[a 12]}) можуть кодуватися в ядрі хазяїна^{[a 13]}. Організмом з найменшим відомим набором генів станом на 2013 рік була Nasuia deltocephalinicola, облігатний симбіонт. Він має лише 137 генів і розмір геному 112 тисяч пар основ^{[a 14][b 6]}.

Для проєкту потрібно було розробити або адаптувати кілька лабораторних технік, оскільки він потребував синтез та маніпуляції з дуже великими ділянками ДНК.

Трансплантація бактеріального геному

У 2007 році команда Вентера повідомила, що їм вдалося перенести хромосому виду Mycoplasma mycoides до Mycoplasma capricolum шляхом:

• виділення геному M. mycoides: м’який лізис клітин, що потрапили в агар - розплавлений агар, змішаний з клітинами та залишений для утворення гелю, з подальшим електрофорезом в пульсувальному полі та виділення смуги правильного розміру (кільцева; 1,25 тисячі пар основ);
• створення компетентних клітин-реципієнтів M. capricolum: ріст у збагачених середовищах супроводжувався голодуванням у збіднених середовищах, де нуклеотидне голодування призводить до інгібування реплікації ДНК та зміни морфології; і
• поліетиленгліколь-опосередкована трансформація кільцевої хромосоми до клітин, що не містять ДНК, з подальшим відбором^{[a 15]}.

Термін трансформація використовується для позначення вставлення вектора в бактеріальну клітину (електропорацією або тепловим шоком). Тут, термін трансплантація застосовується як ядерна трансплантація.

Синтез бактеріальної хромосоми

У 2008 році група Вентера описала виготовлення синтетичного геному, копії послідовності L43967 [Архівовано 5 жовтня 2016 у Wayback Machine.] M. genitalium G37, за ієрархічною стратегією^{[a 16]}:

• Синтез → 1 тисячі пар основ (т.п.о.): Геномна послідовність була синтезована Blue Heron [Архівовано 28 січня 2021 у Wayback Machine.] у 1078 касетах 1080 п.о. із перекриттям 80 п.о. і сайтами рестрикції NotI (неефективна, але рідкісна рестриктаза).
• Лігування → 10 т.п.о.: 109 груп серії з 10 послідовних касет лігували та клонували в E. coli в плазміді й правильну перестановку перевіряли секвенуванням.
• Мультиплексна ПЛР → 100 т.п.о.: 11 груп серії з 10 послідовних 10 т.п.о. збірок (вирощених на дріжджах) об'єднували мультиплексною ПЛР, використовуючи пару праймерів для кожної 10 т.п.о. збірки.
• Виділення та рекомбінація → вторинні вузли були виділені, з’єднані та трансформовані в дріжджові сферопласти без векторної послідовності (присутній у збірці 811-900).

Геном цього результату 2008 року, M. genitalium JCVI-1.0, опублікований на GenBank як CP001621.1. Його не слід плутати з пізнішими синтетичними організмами, позначеними як JCVI-syn, на основі M. mycoides^{[a 16]}.

У 2010 році Вентер та його колеги створили штам Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 із синтетичним геномом^{[a 1]}. Спочатку синтетична конструкція не працювала, щоб точно визначити помилку, що призвела до затримки всього проєкту на 3 місяці, була створена серія напівсинтетичних конструкцій^{[b 4]}. Причиною збою був однонуклеотидний зсув рамки зчитування в DnaA, факторі ініціації реплікації^{[a 1]}.

Метою побудови клітини з синтетичним геномом було випробування методології як кроку до створення модифікованих геномів у майбутньому. Використання природного геному як шаблону мінімізувало потенційні джерела невдач. Кілька відмінностей є у Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 щодо референсного геному, зокрема транспозон IS1 E.coli (інфекція зі стадії 10 т.п.о.) і дублювання 85 п.о., а також елементи, необхідні для розмноження в дріжджах та залишки з сайтів рестрикції^{[a 1]}.

Існували суперечки щодо того, чи JCVI-syn1.0 є справжнім синтетичним організмом. Хоча геном синтезувався хімічно у багатьох ділянках, він був сконструйований так, щоб тісно відповідати батьківському геному і пересаджувався в цитоплазму природної клітини. ДНК сама по собі не може створити життєздатну клітину: білки та РНК необхідні для зчитування ДНК, а ліпідні мембрани - для компартменталізації ДНК та цитоплазми. У JCVI-syn1.0 два види, що використовуються як донор і реципієнт, належать до одного роду, зменшуючи потенційні проблеми невідповідності між білками в цитоплазмі хазяїна та новим геномом^{[a 17]}. Пол Кейм (молекулярний генетик з Університету Північної Аризони у Флегстаффі) зазначив, що «попереду великі виклики, перш ніж генні інженери зможуть змішувати, поєднувати та повністю проєктувати геном організму з нуля»^{[b 4]}.

Водяні знаки

Значно розрекламованою особливістю JCVI-syn1.0 є наявність послідовностей «водяних знаків». 4 водяні знаки (показано на Рисунку S1 у додатковому матеріалі статті^{[a 1]}) — це закодовані повідомлення, записані в ДНК, довжиною 1246, 1081, 1109 та 1222 пар основ відповідно. Ці повідомлення не використовували стандартний генетичний код, в якому послідовності 3 основ ДНК кодують амінокислоти, а новий код, винайдений для цієї мети, який читачам було запропоновано розв'язати. Вміст «водяних знаків» такий:

1. Водяний знак 1: HTML-скрипт, який читається в браузері як текст, що вітає декодера, та інструкції щодо того, як надіслати авторам електронний лист для підтвердження декодування.
2. Водяний знак 2: список авторів та цитата Джеймса Джойса: «Жити, помилятися, падати, тріумфувати, відтворювати життя поза життям».
3. Водяний знак 3: більше авторів та цитата Роберта Оппенгеймера (не вказаний): «Бачити речі не такими, як вони є, а такими, якими вони можуть бути».
4. Водяний знак 4: більше авторів та цитата Річарда Фейнмана: «Те, що я не можу побудувати, я не можу зрозуміти».

JCVI-syn3.0

У 2016 році Інститут Вентера використав гени з JCVI-syn1.0 для синтезу меншого геному, який вони називають JCVI-syn3.0, який містить 531560 пар основ і 473 гени^{[b 7]}. У 1996 році, порівнявши M. genitalium з іншою невеликою бактерією Haemophilus influenza, Аркадій Мушегян та Євген Кунін припустили, що може існувати загальний набір з 256 генів, який може бути мінімальним набором генів, необхідним для життєздатності^{[b 8][a 19]}. У цьому новому організмі кількість генів можна зменшити лише до 473, 149 з яких мають функції, які абсолютно невідомі^{[b 8]}. У 2019 році була опублікована повна обчислювальна модель усіх шляхів у клітині Syn3.0, що представляє першу повну модель in silico для живого мінімального організму^{[a 20]}.

Сприйняття

6 жовтня 2007 року Крейг Вентер заявив в інтерв'ю британській газеті The Guardian, що ця ж команда хімічно синтезувала модифіковану версію єдиної хромосоми Mycoplasma genitalium. Синтезований геном ще не був пересаджений в робочу клітину. Наступного дня канадська група з біоетики, ETC Group опублікувала заяву через свого представника, Пата Муні, сказавши, що «творіння» Вентера  — це «шасі, на якому можна побудувати майже все. Це може бути внеском у людство, таким як нові ліки або величезна загроза людству, така як біозброя». Вентер прокоментував: «Ми маємо справу з великими ідеями. Ми намагаємось створити нову систему цінностей для життя. Коли маєте справу в такому масштабі, ви не можете очікувати, що всі будуть щасливі»^{[b 9]}.

21 травня 2010 року Science повідомив, що група Вентера успішно синтезувала геном бактерії Mycoplasma mycoides з комп'ютерних записів і пересадила синтезований геном в наявну клітину бактерії Mycoplasma capricolum, в якої видалили ДНК. «Синтетична» бактерія була життєздатною, тобто здатною до розмноження^{[b 1]}. Вентер описав його як «перший вид .... що мав батьків комп’ютерів»^{[b 10]}.

Створення нової синтетичної бактерії JCVI-3.0 було оголошено в Science 25 березня 2016 року. Вона має тільки 473 гени. Вентер назвав її «першим дизайнерським організмом в історії» й стверджував, що той факт, що 149 необхідних генів мають невідомі функції, означає, що «у всій галузі біології не вистачає третини того, що має важливе значення для життя»^{[a 21]}.

Висвітлення в пресі

Проєкт отримав значне висвітлення у пресі завдяки видовищності Вентера до тієї міри, що Джей Кіслінг, синтетичний біолог-новатор і засновник Amyris сказав, що «Єдиний регламент, який нам потрібен, — це вуста мого колеги»^{[b 11]}.

Корисність

Вентер стверджував, що синтетичні бактерії — це крок до створення організмів для виробництва водню та біопалива, а також для поглинання вуглекислого газу та інших парникових газів. Джордж Макдональд Черч, інший піонер у синтетичній біології, висловив протилежну думку про те, що створення повністю синтетичного геному не є необхідним, оскільки E. coli росте ефективніше, ніж M. genitalium, навіть з усією додатковою ДНК; він прокоментував, що синтетичні гени були включені в E.coli для виконання деяких із зазначених вище завдань^{[b 12]}.

Інтелектуальна власність

Інститут Дж. Крейга Вентера подав заявку на патенти на геном Mycoplasma laboratorium («мінімальний бактеріальний геном») у США та на міжнародному рівні у 2006 році^{[b 13][b 14][a 22]}. Група ETC, канадська група з біоетики, протестувала на тій підставі, що патент був занадто широким за обсягом^{[b 15]}.

З 2002 по 2010 рік команда Угорської академії наук створювала штам кишкової палички під назвою MDS42, який зараз продається Scarab Genomics of Madison, WI під назвою «Clean Genome. E.coli»^{[b 16]}, в якому 15% геному батьківського штаму (E. coli K-12 MG1655) було видалено задля підвищення ефективності молекулярно-біологічних досліджень. Видалення IS-елементів, псевдогенів і фагів призводить до кращого збереження кодованих плазмідами токсичних генів, які часто інактивуються транспозонами^{[a 23][a 24][a 25]}. Біохімічні властивості та реплікаційна машинерія не зазнали змін.

• Штучне життя
• Синтетична біологія

Першоджерела

Популярна преса

• J. Craig Venter Institute: Research Groups