กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน

เลนส์แม่เหล็กไฟฟ้าตัวแรกได้รับการพัฒนาในปี ค.ศ. 1926 โดยนักฟิสิกส์ Hans Busch^[2]

อ้างถึง Dennis Gabor ในปี ค.ศ. 1928 นักฟิสิกส์ Leó Szilárd ได้พยายามที่จะโน้มน้าวให้ Busch ทำการสร้างกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนตัวหนึ่งที่เขาจะได้ยื่นจดสิทธิบัตร^[3]

นักฟิสิกส์ชาวเยอรมัน Ernst Ruska และวิศวกรไฟฟ้า Max Knoll ได้สร้างกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนต้นแบบในปี ค.ศ. 1931 มีกำลังการขยายสี่ร้อยเท่า อุปกรณ์นี้ได้สาธิตหลักการของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนเป็นครั้งแรก^[4] อีกสองปีต่อมาในปี ค.ศ. 1933 Ruska ได้สร้างกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนที่มีความคมชัดเกินกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบแสงสามารถทำได้^[4] นอกจากนี้ Reinhold Rudenberg ผู้อำนวยการทางวิทยาศาสตร์ของ Siemens-Schuckertwerke ได้รับสิทธิบัตรสำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนในเดือนพฤษภาคม ค.ศ. 1931

ในปี ค.ศ. 1932 Ernst Lubcke แห่ง Siemens & Halske ได้สร้างภาพออกมาได้จากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนต้นแบบ เป็นการประยุกต์ใช้แนวคิดที่ได้อธิบายเอาไว้ในการยื่นขอจดสิทธิบัตรของ Rudenberg^[5] ห้าปีต่อมา (1937) บริษัทได้ให้ทุนกับงานของ Ernst Ruska และ Bodo von Borries และว่าจ้าง Helmut Ruska (น้องชายเอิร์นส์) ในการพัฒนาแอปพลิเคชันสำหรับกล้องจุลทรรศน์โดยเฉพาะอย่างยิ่งกับตัวอย่างทางชีวภาพ^[4][6] เช่นกันในปี 1937 Manfred von Ardenne ได้บุกเบิกกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (อังกฤษ: scanning electron microscope (SEM))^[7] กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน"ในทางปฏิบัติ"ตัวแรกถูกสร้างขึ้นในปี ค.ศ. 1938 ที่มหาวิทยาลัยโตรอนโตโดย Eli Franklin Burton และนักเรียน Cecil Hall James Hillier และ Albert Prebus จากนั้นซีเมนส์ได้ผลิตกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) เชิงพาณิชย์ตัวแรกในปี ค.ศ. 1939^[8] แม้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนร่วมสมัยมีกำลังการขยายถึงสองล้านเท่าก็ตาม ในฐานะที่เป็นเครื่องมือทางวิทยาศาสตร์ พวกมันยังคงขึ้นอยู่กับต้นแบบของ Ruska

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM)

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (TEM) เป็นรูปแบบเดิมของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน มันใช้ลำแสงอิเล็กตรอนไฟฟ้าแรงสูงในการสร้างภาพ ลำแสงอิเล็กตรอนถูกผลิตโดยปืนอิเล็กตรอนที่ทั่วไปแล้วได้ติดตั้งแคโทดที่มีไส้หลอดเป็นทังสเตนเพื่อเป็นแหล่งที่มาของอิเล็กตรอน ลำแสงอิเล็กตรอนถูกเร่งความเร็วโดยขั้วบวกปกติที่ 100 กิโลอิเล็กตรอนโวลท์ (kev) (40-400 kev) เมื่อเทียบกับแคโทด จากนั้นลำแสงจะถูกโฟกัสโดยเลนส์ไฟฟ้าสถิตและคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้าและส่องผ่านชิ้นงานที่มีบางส่วนที่โปร่งใสกับอิเล็กตรอนและบางส่วนกระจายลำแสงออกไป เมื่อลำแสงอิเล็กตรอนผ่านพ้นออกมาจากชิ้นงานมันจะเก็บข้อมูลเกี่ยวกับโครงสร้างของชิ้นงานออกมาด้วยซึ่งจะมีการขยายโดยระบบเลนส์ใกล้วัตถุ (อังกฤษ: objective lens) ของกล้องจุลทรรศน์นั้น การเปลี่ยนแปลงเชิงพื้นที่ในข้อมูลนี้ ("ภาพ") อาจสามารถดูได้โดยการฉายภาพอิเล็กตรอนที่ถูกขยายแล้วนี้ลงบนหน้าจอดูเรืองแสงที่เคลือบด้วยวัสดุสารเรืองแสงหรือ scintillator เช่นสังกะสีซัลไฟด์ หรืออีกทางเลือกหนึ่งภาพสามารถถูกบันทึกได้แบบการถ่ายรูปโดยการฉายแสงอิเล็กตรอนโดยตรงลงบนแผ่นฟิล์มถ่ายรูป หรือสารเรืองแสงความละเอียดสูงอาจต่อเข้ากับตัวรับแสงของกล้องถ่ายรูปที่ใช้ CCD (อุปกรณ์ถ่ายเทประจุ) ด้วยระบบเลนส์ออปติคอลหรือตัวนำแสงแบบใยแก้ว ภาพที่จับได้โดย CCD อาจจะแสดงบนหน้าจอคอมพิวเตอร์

ความละเอียดของ TEM ถูกจำกัดเป็นส่วนใหญ่โดยความผิดปกติแบบทรงกลม (อังกฤษ: spherical aberration) (การหักเหของแสงตามขอบเลนส์) แต่รุ่นใหม่ของตัวแก้ความผิดปกติสามารถเอาชนะการผิดปกติแบบทรงกลมเหล่านั้นได้เพื่อเพิ่มความละเอียด การแก้ไขด้วยฮาร์ดแวร์ของความผิดปกติแบบทรงกลมสำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนความละเอียดสูงแบบส่องผ่าน (อังกฤษ: high-resolution transmission electron microscopy (HRTEM)) สามารถผลิตภาพที่มีความละเอียดต่ำกว่า 0.5 อังสตรอม (50 picometres)^[1] และกำลังขยายสูงกว่า 50 ล้านเท่า^[9] ความสามารถในการกำหนดตำแหน่งของอะตอมภายในวัสดุได้ทำให้ HRTEM เป็นเครื่องมือสำคัญสำหรับการวิจัยและการพัฒนาด้านนาโนเทคโนโลยี^[10]

โหมดที่สำคัญของการใช้ TEM คือการเลี้ยวเบนของอิเล็กตรอน (อังกฤษ: electron diffraction) ข้อดีของการเลี้ยวเบนของอิเล็กตรอนที่เหนือกว่าเทคนิคของผลึกวิทยา (อังกฤษ: X-ray crystallography) อยู่ที่ชิ้นงานไม่จำเป็นต้องเป็นผลึกเดี่ยวหรือแม้กระทั่งเป็นผงผลึก (อังกฤษ: polycrystalline powder) และนอกจากนี้การฟื้นฟูโครงสร้างด้วยการแปลงแบบฟูริเยร์ (อังกฤษ: Fourier transform reconstruction) ของโครงสร้างที่ถูกขยายแล้วของวัตถุจะเกิดขึ้นทางกายภาพ จึงหลีกเลี่ยงความจำเป็นสำหรับการแก้ปัญหาแบบเฟส (อังกฤษ: phase problem) ที่ต้องเผชิญกับ X-ray crystallographers หลังจากได้รับรูปแบบ X-ray diffraction ของผลึกเดี่ยวหรือผงผลึกของพวกมัน ข้อเสียที่สำคัญของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านคือความจำเป็นสำหรับตัวอย่างที่ต้องใช้ส่วนที่บางมากโดยทั่วไปประมาณ 100 นาโนเมตร ตัวอย่างทางชีวภาพโดยทั่วไปจะต้องคงที่ทางเคมี แห้งและถูกฝังตัวอยู่ในเรซินลิเมอร์เพื่อรักษาเสถียรภาพของพวกมันให้พอที่จะยอมให้ตัดเซ็กชั่นอย่างบางเฉียบได้ เซ็กชั่นของตัวอย่างทางชีวภาพ โพลิเมอร์อินทรีย์และวัสดุที่คล้ายกันอาจจะต้องการการดูแลเป็นพิเศษด้วยป้ายชื่ออะตอมหนักเพื่อให้ได้ความคมชัดของภาพตามที่ต้องการ

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (SEM)

ไม่เหมือนกับแบบ TEM ที่อิเล็กตรอนของลำแสงไฟฟ้าแรงสูงจะเก็บภาพของชิ้นงาน, ลำแสงอิเล็กตรอนของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (SEM)^[11] ไม่ได้เก็บภาพที่สมบูรณ์ของชิ้นงานได้ตลอดเวลา SEM จะผลิตภาพโดยตรวจสอบชิ้นงานโดยใช้ลำแสงอิเล็กตรอนที่โฟกัสให้กราด(สแกน)ไปทั่วพื้นที่สี่เหลี่ยมของชิ้นงาน (เหมือนการสแกนจอภาพ CRT (อังกฤษ: raster scan)) เมื่อลำแสงอิเล็กตรอนมีปฏิสัมพันธ์กับชิ้นงาน มันจะสูญเสียพลังงานตามความหลากหลายของกลไก พลังงานที่หายไปจะถูกแปลงเป็นรูปแบบทางเลือกอื่นเช่นความร้อน การปล่อยอิเล็กตรอนทุติยภูมิพลังงานต่ำและอิเล็กตรอนสะท้อนกลับพลังงานสูง การปล่อยแสง (cathodoluminescence) หรือการเปล่งรังสีเอกซ์ พลังงานทั้งหมดเหล่านี้เป็นสัญญาณของข้อมูลเกี่ยวกับคุณสมบัติของพื้นผิวของชิ้นงาน เช่นรูปร่างและองค์ประกอบของมัน ภาพที่แสดงโดย SEM จะแปลความเข้มที่แตกต่างใดๆของสัญญาณเหล่านี้ให้เป็นภาพที่อยู่ในตำแหน่งที่สอดคล้องกับตำแหน่งของลำแสงบนชิ้นงานตอนที่สัญญาณถูกสร้างขึ้น ในภาพ SEM ของมดที่แสดงทางด้านขวา ภาพถูกสร้างขึ้นมาจากสัญญาณที่ผลิตโดยเครื่องตรวจจับอิเล็กตรอนทุติยภูมิซึ่งเป็นโหมดการสร้างภาพปกติหรือทั่วไปใน SEMs ส่วนใหญ่

โดยทั่วไปความละเอียดของภาพจาก SEM มีความคมชัดด้อยกว่าของ TEM อย่างไรก็ตามเนื่องจากภาพ SEM เป็นกระบวนการที่เกิดบนพื้นผิวมากกว่าการส่องผ่าน มันจึงสามารถที่จะสร้างภาพตัวอย่างที่เป็นกลุ่มได้ในขนาดหลายเซนติเมตรขึ้นไปและ (ขึ้นอยู่กับการออกแบบและการตั้งค่าของเครื่องมือ) มีความลึกของสนามที่สูง ดังนั้นมันจึงสามารถผลิตภาพที่มีการแสดงที่ดีของรูปทรงสามมิติของกลุ่มตัวอย่าง ประโยชน์ของ SEM อีกประการหนึ่งคือความหลากหลายของมันที่เรียกว่ากล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดสิ่งแวดล้อม (อังกฤษ: environmental scanning electron microscope (Esem)) ที่สามารถผลิตภาพที่มีคุณภาพและความละเอียดเพียงพอสำหรับกลุ่มตัวอย่างที่เปียกหรือถูกเก็บอยู่ในสูญญากาศหรือก๊าซต่ำ อุปกรณ์นี้จะช่วยอำนวยความสะดวกในการถ่ายภาพตัวอย่างทางชีวภาพที่มีความไม่แน่นอนในสูญญากาศสูงของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบเดิม

สี

ในคอนฟิกูเลชั่นที่พบมากที่สุดของพวกมันกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนผลิตภาพที่มีค่าความสว่างเดียวต่อพิกเซลโดยผลลัพธ์ที่ได้แสดงผลมักจะอยู่ในระดับสีเทา^[12] อย่างไรก็ตามบ่อยครั้งที่ภาพเหล่านี้จะทำเป็นสีโดยใช้ซอฟแวร์ที่มีการตรวจสอบคุณลักษณะหรือง่ายๆเพียงแค่ใช้มือด้วยโปรแกรมแก้ไขภาพกราฟิก วิธีนี้มักจะทำเพื่อความสวยงามหรือสำหรับการอธิบายโครงสร้างและโดยทั่วไปก็ไม่ได้เพิ่มข้อมูลใดๆเกี่ยวกับตัวอย่าง^[13]

ในบางคอนฟิกูเลชั่นข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับคุณสมบัติของชิ้นงานถูกรวบรวมต่อพิกเซล ปกติโดยการใช้เครื่องตรวจจับหลายชั้น^[14] ใน SEM คุณลักษณะของรูปร่างและความคมชัดแบบวัสดุสามารถสร้างภาพได้โดยใช้เครื่องตรวจจับอิเล็กตรอนสะท้อนกลับหนึ่งคู่และคุณลักษณะดังกล่าวสามารถซ้อนทับในภาพสีภาพเดียวโดยการกำหนดสีหลักที่แตกต่างกันไปแต่ละคุณลักษณะ^[15] ในทำนองเดียวกันการรวมกันของสัญญาณอิเล็กตรอนสะท้อนกลับและทุติยภูมิสามารถกำหนดให้มีสีที่แตกต่างกันและซ้อนทับกันบน Micrograph สีเดียวที่แสดงคุณสมบัติของชิ้นงานพร้อมกัน^[16]

ในวิธีการที่คล้ายกัน อิเล็กตรอนทุติยภูมิและเครื่องตรวจจับอิเล็กตรอนสะท้อนกลับมีการซ้อนทับกันและสีหนึ่งได้ถูกกำหนดให้ในแต่ละภาพที่จับได้โดยแต่ละเครื่องตรวจจับ ทำให้ได้ผลในตอนท้ายเป็นภาพสีผสมที่สีทั้งหลายมีความสัมพันธ์กับความหนาแน่นของส่วนประกอบต่างๆ วิธีการนี้เป็นที่รู้จักกันว่าเป็น SEM แบบมีสีที่ขึ้นอยู่กับความหนาแน่น (อังกฤษ: Density-dependent colour SEM (DDC-SEM)) ภาพ micrograph ที่ผลิตโดย DDC-SEM จะเก็บข้อมูลรูปร่าง(ซึ่งถูกจับได้ดีกว่าที่จับได้โดยต้วตรวจจับอิเล็กตรอนทุติยภูมิและผสมเข้าด้วยกันกับข้อมูลเกี่ยวกับความหนาแน่น)ที่ได้รับจากเครื่องตรวจจับอิเล็กตรอนสะท้อนกลับ^[17]

บางชนิดของตัวตรวจจับที่ใช้ใน SEM มีความสามารถในการวิเคราะห์และสามารถให้ข้อมูลหลายรายการในแต่ละพิกเซล ตัวอย่างเช่นตัวตรวจจับในเครื่องเอกซ์เรย์สเปกโตรสโคปีแบบพลังงานกระจาย (อังกฤษ: Energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS)) ที่ใช้ในการวิเคราะห์ธาตุและระบบกล้องจุลทรรศน์แบบเปล่งแสงด้วยคาโทด (อังกฤษ: Cathodoluminescence microscope (CL)) ที่วิเคราะห์ความเข้มข้นและสเปกตรัมของการเปล่งแสงที่เกิดขึ้นจากอิเล็กตรอน (อังกฤษ: electron-induced luminescence) ใน (ตัวอย่างเช่น) ชิ้นตัวอย่างทางธรณีวิทยา ในระบบ SEM การใช้ตัวตรวจจับเหล่านี้มันเป็นเรื่องธรรมดาที่จะให้รหัสสีกับสัญญาณทั้ได้และซ้อนทับพวกมันออกกมาเป็นนภาพสีภาพเดียวเพื่อที่ว่าความแตกต่างทั้งหลายในการกระจายของส่วนประกอบต่างๆของชิ้นงานสามารถมองเห็นได้อย่างชัดเจนและสามารถเทียบกันได้ เพื่อเป็นทางเลือก ภาพอิเล็กตรอนทุติยภูมิมาตรฐานสามารถถูกรวมเข้ากับช่องทางแบบองค์ประกอบ (อังกฤษ: compositional channel) หนึ่งช่องทางหรือมากกว่าเพื่อให้โครงสร้างของชิ้นงานและองค์ประกอบสามารถนำมาเปรียบเทียบกันได้ ภาพดังกล่าวสามารถถูกทำขึ้นในขณะที่มีการรักษาความสมบูรณ์เต็มรูปแบบของสัญญาณเดิมซึ่งไม่ได้ถูกแก้ไขในทางใดทางหนึ่ง

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสะท้อน (REM)

ในกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสะท้อน (อังกฤษ: Reflection electron microscope (REM)) เช่นเดียวกับใน TEM ลำแสงอิเล็กตรอนตกลงบนพื้นผิว แต่แทนที่จะใช้การส่องผ่าน (ใน TEM) หรืออิเล็กตรอนทุติยภูมิ (ใน SEM) ลำแสงที่สะท้อนของอิเล็กตรอนที่กระจายอย่างยืดหยุ่นจะถูกตรวจพบ เทคนิคนี้จะมักจะเชื่อมต่อเข้ากับการเลี้ยวเบนของอิเล็กตรอนพลังงานสูงสะท้อน (อังกฤษ: reflection high energy electron diffraction (RHEED)) และเครื่องสเปกโทรสโกปีแบบสะท้อนการสูญเสียพลังงานสูง (อังกฤษ: reflection high-energy loss spectroscopy (RHELS)) การแปรเปลี่ยนอีกประการหนึ่งคือกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนพลังงานต่ำแบบขั้วหมุน (อังกฤษ: spin-polarized low-energy electron microscopy (SPLEEM)) ซึ่งจะใช้สำหรับการมองหาจุลภาคของโดเมนแม่เหล็ก^[18]

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านและส่องกราด (STEM)

บทความหลัก: กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านและส่องกราดเครื่อง STEM นี้จะสแกนลำแสงที่โฟกัสแล้วให้ตกกระทบทั่วชิ้นงาน (เช่นเดียวกับ TEM) ชิ้นงานจะถูกทำให้บางเพื่ออำนวยความสะดวกในการตรวจจับอิเล็กตรอนที่กระจาย"ผ่าน"ชิ้นงานความละเอียดสูงของ TEM จึงสามารถเป็นไปได้ใน STEM การดำเนินการ (และความผิดปรกติ) จากการโฟกัสจะเกิดขึ้นก่อนที่อิเล็กตรอนจะกระทบชิ้นงานใน STEM แต่ใน TEM จะเกิดทีหลัง STEM จะใช้การสแกนลำแสงเหมือนกับ SEM เพื่อลดความยุ่งยากในการถ่ายภาพเป็นรูปวงแหวนสนามมืด (อังกฤษ: annular dark-field imaging) (ซึ่งเป็นเทคนิคการวิเคราะห์อีกอันหนึ่ง) แต่ยังหมายถึงว่าข้อมูลภาพจำเป็นต้องอยู่ในรูปอนุกรมมากกว่าอยู่ในรูปขนาน บ่อยครั้งที่ TEM สามารถถูกติดตั้งด้วยตัวเลือกการสแกน มันจึงสามารถทำงานได้ทั้งแบบ TEM และ STEM

วัสดุที่จะดูด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนอาจจำเป็นต้องผ่านกระบวนการเพื่อผลิตเป็นตัวอย่างชิ้นงานที่เหมาะสม เทคนิคที่จำเป็นจะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับชิ้นงานและการวิเคราะห์ที่จำเป็น ได้แก่:

• "fixation ทางเคมี" (fixation เป็นขั้นตอนที่สำคัญในวิทยาการด้านเนื้อเยื่อ ด้านพยาธิวิทยา และด้านชีววิทยาในการเตรียมเซ็กชั่นของเนื้อเยื่อไม่ให้เน่าสลาย) - สำหรับตัวอย่างทางชีวภาพที่มีจุดมุ่งหมายเพื่อสร้างความมั่นคงของโครงสร้างจุลโมเลกุลเคลื่อนที่ของตัวอย่างชิ้นงานโดยการเชื่อมขวางทางเคมีของโปรตีนที่มีอัลดีไฮด์เช่นฟอร์มาลดีไฮด์และ glutaraldehyde และไขมันที่มีออสเมียม tetroxide
• "การย้อมสีเชิงลบ" - สารแขวนลอยที่มีอนุภาคนาโนหรือวัสดุชีวภาพที่ละเอียด (เช่นไวรัสและแบคทีเรีย) จะถูกผสมในเวลาสั้น ๆ เข้ากับสารละลายเจือจางของสารละลายทึบอิเล็กตรอน (อังกฤษ: electron-opaque solution) เช่น ammonium molybdate หรือ uranyl acetate (หรือ formate) หรือ phosphotungstic acid ส่วนผสมนี้จะถูกนำไปใช้กับกริดของ EM ที่เคลือบอย่างเหมาะสมจากนั้นจะถูกย้อมสีแล้วปล่อยให้แห้ง TEM จะถูกใช้เพื่อดูการเตรียมความพร้อมโดยไม่ชักช้าเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด วิธีการมีความสำคัญในทางจุลชีววิทยาเพื่อชี้ชัดเกี่ยวกับโครงสร้างของสัตว์และพืชได้อย่างรวดเร็วแต่คร่าว ๆ แต่ยังสามารถนำมาใช้เป็นพื้นฐานสำหรับการฟื้นฟู 3 มิติความละเอียดสูงโดยใช้วิธีการสร้างภาพด้วย EM อีกด้วยเมื่อฟิล์มคาร์บอนถูกใช้สำหรับการสนับสนุน นอกจากนี้การย้อมสีเชิงลบยังใช้สำหรับการสังเกตอนุภาคนาโนอีกด้วย
• "fixation ด้วยความเย็นยิ่งยวด" (อังกฤษ: Cryofixation) - การแช่แข็งตัวอย่างชิ้นงานอย่างรวดเร็วมาก ๆ ในอีเทนเหลวและรักษาสภาวะที่อุณหภูมิไนโตรเจนเหลวหรือแม้แต่ฮีเลียมเหลวเพื่อให้น้ำก่อรูปเป็นน้ำแข็ง (ไม่ใช่ผลึก) แบบใสเหมือนแก้ว วิธีนี้จะเก็บรักษาชิ้นงานในช่วงเวลาสั้น ๆ ของสภาวะสารละลายของมัน สาขาในภาพรวมทั้งหมดที่เรียกว่ากล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบเย็นยิ่งยวด (อังกฤษ: cryo-electron microscopy) ได้แยกสาขาออกจากเทคนิคนี้ ด้วยการพัฒนาของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบเย็นยิ่งยวดของเซ็กชั่นที่ใสเหมือนแก้ว (อังกฤษ: cryo-electron microscopy of vitreous sections (CEMOVIS)) ตอนนี้มันเป็นไปได้ที่จะสังเกตเห็นตัวอย่างชิ้นงานได้จากตัวอย่างทางชีวภาพใด ๆ ที่ใกล้เคียงกับสภาวะแรกเริ่ม^{[ต้องการอ้างอิง]}
• "การขจัดน้ำออก" (อังกฤษ: Dehydration) - การอบแห้งแช่แข็งหรือการแทนที่น้ำด้วยตัวทำละลายอินทรีย์เช่นเอทานอลหรืออะซิโตน ตามด้วยการอบแห้งที่จุดวิกฤตหรือการแทรกซึมด้วยการฝังเรซิ่น
• "การฝัง-ตัวอย่างทางชีวภาพ" - หลังจากการขจัดน้ำออก เนื้อเยื่อที่จะส่องดูด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านจะถูกฝังเพื่อที่จะสามารถแบ่งเป็นหลาย ๆ เซ็กชั่นให้พร้อมสำหรับการส่องดู ในการทำเช่นนี้เนื้อเยื่อจะถูกส่งผ่าน 'ตัวทำละลายถ่ายโอน' เช่นโพรพิลีนออกไซด์ (epoxypropane) จากนั้นก็แทรกซึมด้วยอีพอกซีเรซินเช่น Araldite, Epon หรือ Durcupan^[19]; เนื้อเยื่อก็อาจจะถูกฝังโดยตรงในน้ำอะคริลิกเรซินที่ผสมกับน้ำได้ หลังจากเรซินกลายเป็นโพลิเมอร์ (แข็งตัว) ชิ้นตัวอย่างจะถูกตัดแบ่งให้เป็นชิ้นบาง ๆ (เซ็กชั่นที่บางเฉียบ) และย้อมสี - มันจะพร้อมสำหรับการส่องดู
• "การฝัง-วัสดุ" - หลังจากที่ฝังไว้ในเรซิน ชิ้นตัวอย่างมักจะถูกเจียและขัดผิวให้มันเหมือนกระจกโดยใช้วัสดุขัดแบบละเอียด กระบวนการขัดจะต้องดำเนินการอย่างระมัดระวังเพื่อลดรอยขีดข่วนและสิ่งแปลกปลอมอื่น ๆ ที่จะลดคุณภาพของภาพ
• "การบังเงาด้วยโลหะ" (อังกฤษ: Metal shadowing) - โลหะ (เช่นทองคำขาว) จะถูกทำให้ระเหยจากอิเล็กโทรดเหนือหัวและจ่ายให้กับผิวหน้าของตัวอย่างชิ้นงานทางชีวภาพที่มุมมุมหนึ่ง ตามด้วยการสลายตัวของวัสดุชีวภาพในอ่างกรดเหลือไว้แต่เพียงพื้นผิวโลหะจำลองที่เหมือนเดิม จากนั้นแบบจำลองพื้นผิวโลหะนี้จะถูกตรวจสอบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน การแปรเปลี่ยนความหนาและมุมของพื้นผิวโลหะที่ช่วยให้ภาพเกิดขึ้นเนื่องจากอิเล็กตรอนที่ตกกระทบจะกระจายไปในทิศทางที่แตกต่างกันมากกว่าที่จะผ่านตัวมัน
• "การตัด section" - เป็นการสร้างชิ้นบาง ๆ ของชิ้นงาน กึ่งโปร่งใสให้กับอิเล็กตรอน โดยสามารถตัดบนเครื่องตัดชิ้นเนื้อขนาดจิ๋ว (อังกฤษ: ultramicrotome) ด้วยมีดทำด้วยเพชรเพื่อผลิตชิ้นบางเฉียบหนาประมาณ 60-90 นาโนเมตร มีดทำด้วยแก้วใช้แล้วทิ้งยังสามารถนำมาใช้ได้เช่นกันเพราะพวกมันสามารถทำขึ้นในห้องปฏิบัติการและถูกกว่ามาก
• "การย้อมสี" - ใช้โลหะหนักเช่นตะกั่วหรือยูเรเนียมหรือทังสเตนเพื่อกระจายอิเล็กตรอนที่ใช้สร้าง จึงได้ความสว่างที่ตัดกันระหว่างโครงสร้างที่แตกต่างกันอันเนื่องมาจากวัสดุหลายอย่าง (โดยเฉพาะอย่างยิ่งทางชีวภาพ) เกือบจะ "โปร่งใส" ต่ออิเล็กตรอน (วัตถุที่มีเฟสอ่อนแอ) ในทางชีววิทยาตัวอย่างหลายชิ้นงานสามารถนำมาย้อมสี "พร้อมกัน" ก่อนที่จะฝังและทำหลังจากการตัด section ก้ได้ โดยปกติ section ที่บางจะถูกย้อมเป็นเวลาหลายนาทีด้วยสารละลายที่ประกอบด้วยน้ำหรือแอลกอฮอล์ของอะซิเตท uranyl ตามด้วยซิเตรตตะกั่วที่ประกอบด้วยน้ำ
• "เศษแตกหักแช่แข็งหรือรอยเจาะแช่แข็ง" - วิธีการเตรียมอย่างหนึ่งที่เป็นประโยชน์อย่างยิ่งเฉพาะสำหรับการตรวจสอบเยื่อไขมันและส่วนที่เป็นโปรตีนของมันในมุมมอง "ด้านหน้า" เนื้อเยื่อสดหรือเซลล์แขวนลอยจะถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็ว (ด้วยความเย็นยิ่งยวด) จากนั้นทำให้แตกเป็นชิ้นเล็กๆโดยเพียงแค่เคาะให้แตกหรือโดยการใช้เครื่องตัดชิ้นเนื้อในขณะที่มีการคงระดับที่อุณหภูมิไนโตรเจนเหลว จากนั้นพื้นผิวที่แตกร้าวและเย็น (บางครั้ง "ถูกเจาะ" โดยการเพิ่มอุณหภูมิไปที่ประมาณ -100 องศาเซลเซียสเป็นเวลาหลายนาทีเพื่อรอให้น้ำแข็งบางส่วนระเหิด) จะถูกบังเงาด้วยไอระเหยของทองคำขาวหรือทองที่มุมเฉลี่ย 45° ในเครื่องสร้างไอระเหยสุญญากาศสูง ชั้นเคลือบที่สองของคาร์บอนที่ระเหยตั้งฉากกับระนาบพื้นผิวเฉลี่ยมักจะดำเนินการเพื่อปรับปรุงเสถียรภาพของสารเคลือบผิวจำลอง ตัวอย่างชิ้นงานจะถูกทำกลับไปที่อุณหภูมิและความดันห้อง จากนั้นแบบจำลองโลหะที่ถูก "บังเงาล่วงหน้า" ที่เปราะบางมากของพื้นผิวที่แตกหักจะถูกปล่อยออกมาจากวัสดุชีวภาพต้นแบบโดยการย่อยทางเคมีอย่างระมัดระวังด้วยกรดหรือสารละลายไฮโปคลอไรต์หรือผงซักฟอก Sodium dodecyl sulfate (SDS) แบบจำลองที่ยังคงลอยอยู่จะถูกล้างให้สะอาดให้ปราศจากสารเคมีตกค้างแล้วเกี่ยวอย่างระมัดระวังบนกริดละเอียด ทำให้แห้งแล้วส่องดูใน TEM
• "การสีลำแสงไอออน" (อังกฤษ: ion beam milling) - ชิ้นตัวอย่างจะถูกทำให้บางจนกระทั่งพวกมันจะโปร่งใสกับอิเล็กตรอนโดยการยิงไอออน (ปกติเป็นอาร์กอน) ไปที่ผิวจากมุมมุมหนึ่งและด้วยการพ่นวัสดุจากพื้นผิว ชั้นระดับรองนี้คือการสีแบบลำแสงไอออนที่เน้นเฉพาะจุด (อังกฤษ: focused ion beam milling) ที่ไอออนของแกลเลียมจะถูกใช้ในการผลิตเยื่อที่โปร่งใสต่ออิเล็กตรอนในพื้นที่เฉพาะเจาะจงของชิ้นตัวอย่าง เช่นผ่านอุปกรณ์ภายในไมโครโปรเซสเซอร์ การสีลำแสงไอออนยังอาจนำไปใช้สำหรับการขัดภาคตัดขวางก่อนการที่จะมีการวิเคราะห์ด้วย SEM ของวัสดุที่ยากต่อการเตรียมความพร้อมโดยการใช้เครื่องขัดด้วยกลไกทั่วไป
• "การเคลือบให้เป็นตัวนำ" (อังกฤษ: Conductive coating) - การเคลือบอย่างบางเฉียบด้วยวัสดุที่นำไฟฟ้า โดยให้ติดแน่นโดยการระเหยแบบสูญญากาศสูงหรือโดยการเคลือบแบบพ่นในสุญญากาศต่ำของชิ้นตัวอย่าง การทำแบบนี้ก็เพื่อป้องกันไม่ให้เกิดการสะสมของสนามไฟฟ้าสถิตย์บนตัวอย่างอันเนื่องมาจากการฉายรังสีอิเล็กตรอนที่จำเป็นในระหว่างการถ่ายภาพ วัสดุที่ใช้เคลือบได้แก่ทองหรือทอง/แพลเลเดียมหรือแพลทินัมหรือทังสเตนหรือกราไฟท์ ฯลฯ
• "การต่อสายดิน" - เพื่อหลีกเลี่ยงการสะสมประจุไฟฟ้าบนตัวอย่างที่เคลือบด้วยสารตัวนำ มักจะเป็นการเชื่อมต่อแบบไฟฟ้ากับผู้ถือตัวอย่างที่เป็นโลหะ บ่อยครั้งที่กาวหรือสารยึดติดที่นำไฟฟ้าได้จะถูกนำมาใช้เพื่อการนี้

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนมีราคาแพงในการสร้างและบำรุงรักษา แต่เงินทุนและค่าใช้จ่ายในการดำเนินงานของกล้องจุลทรรศน์ระบบแสงจุดโฟกัสร่วมในเวลานี้จะคาบเกี่ยวกับบรรดาของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนพื้นฐาน กล้องจุลทรรศน์ที่ออกแบบเพื่อให้บรรลุความละเอียดสูงจะต้องติดตั้งอยู่ในอาคารที่มั่นคง (บางครั้งใต้ดิน) ที่มีบริการพิเศษเช่นระบบกำจัดสนามแม่เหล็ก

ชิ้นตัวอย่างส่วนใหญ่จะต้องมีการส่องดูในสุญญากาศเนื่องจากโมเลกุลที่ประกอบขึ้นเป็นอากาศจะทำให้อิเล็กตรอนถูกกระเจิง ข้อยกเว้นเดียวสำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดสิ่งแวดล้อมซึ่งยอมให้ตัวอย่างที่ผ่านการชุ่มน้ำสามารถส่องดูได้ในสภาพแวดล้อมที่เปียกแรงดันต่ำ (ไม่เกิน 20 Torr หรือ 2.7 ปาสคาล)

กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดที่ทำงานในโหมดสุญญากาศสูงธรรมดามักจะสร้างภาพชิ้นงานที่เป็นตัวนำไฟฟ้า ดังนั้นวัสดุที่ไม่นำไฟฟ้าจึงต้องเคลือบด้วยสารตัวนำ (ทอง/โลหะผสมแพลเลเดียม คาร์บอน ออสเมียม ฯลฯ) โหมดแรงดันต่ำของกล้องจุลทรรศน์ที่ทันสมัยทำให้เป็นไปได้ในการการสังเกตชิ้นงานที่ไม่นำไฟฟ้าโดยไม่ต้องเคลือบ วัสดุที่ไม่นำไฟฟ้าสามารถถ่ายภาพโดยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดแบบความดันแปร (หรือแบบสิ่งแวดล้อม)

ชิ้นตัวอย่างขนาดเล็กและมีความเสถียรเช่นท่อคาร์บอนนาโน เปลือกไดอะตอม (อังกฤษ: diatom frustules) และผลึกแร่ขนาดเล็ก (เช่นแร่ใยหิน) ไม่จำเป็นต้องมีการดูแลเป็นพิเศษก่อนที่จะมีการตรวจสอบในกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน ตัวอย่างของวัสดุไฮเดรทรวมทั้งเกือบทั้งหมดของตัวอย่างทางชีวภาพจะต้องมีการจัดเตรียมในรูปแบบต่าง ๆ เพื่อสร้างเสถียรภาพให้กับพวกมัน ลดความหนาของพวกมัน (ทำเซ็กชั่นให้บางเฉียบ) และเพิ่มความคมชัดด้านอิเล็กตรอนออปติคอล (ย้อมสี) กระบวนการเหล่านี้อาจส่งผลให้เกิด"สิ่งแปลกปลอม" แต่มักจะสามารถระบุได้โดยการเปรียบเทียบผลลัพธ์ที่ได้โดยใช้วิธีการเตรียมชิ้นงานหลาย ๆ อย่างที่แตกต่างกันอย่างสิ้นเชิง นักวิทยาศาสตร์ที่ทำงานในสนามโดยทั่วไปเชื่อว่าผลลัพธ์จากเทคนิคการเตรียมการที่หลากหลายต่าง ๆ จะถูกนำมาเปรียบเทียบและไม่มีเหตุผลที่พวกมันจะผลิตสิ่งแปลกปลอมที่คล้ายกันและมันมีเหตุผลที่เชื่อได้ว่าคุณสมบัติกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนสอดคล้องกับบรรดาคุณสมบัติของเซลล์ทั้งหลายที่มีชีวิต ตั้งแต่ปี 1980s การวิเคราะห์ของชิ้นตัวอย่างที่มีการเตรียมแบบเย็นยิ่งยวดจนกลายเป็นแก้วยังได้กลายเป็นที่ใช้มากขึ้นโดยนักวิทยาศาสตร์ ยืนยันมากขึ้นถึงความถูกต้องของเทคนิคนี้^[20][21][22]