Витамин B₁₂

Впервые влияние на развитие анемии недостатка какого-то вещества обнаружил исследователь Уильям Мёрфи в эксперименте на собаках, у которых была искусственно вызвана анемия. Подопытные собаки, которым давали в пищу большое количество печени, излечивались от анемии. Впоследствии учёные Джордж Уипл и Джордж Майнот поставили перед собой задачу выделить из печени фактор, непосредственно отвечающий за это лечебное свойство. Это им удалось, новый противоанемийный фактор получил название витамина B₁₂, и все трое учёных в 1934 году были удостоены Нобелевской премии по медицине^[7].

Молекулярную химическую структуру цианокобаламина установила Дороти Кроуфут-Ходжкин в 1956 году по данным рентгеноструктурного анализа^[8].

К кобаламинам относятся^[1][9]:

• собственно цианокобаламин (Со-α-[α-(5,6-диметил-бензимидазолил)]-(Со-β-циано)кобамид; CN-Cbl; С₆₃H₈₉O₁₄N₁₄PCo) в котором с кобальтом связывается CN^–-группа, наиболее устойчивое соединение, синтезируемое или образующееся при искусственном выделении из живых организмов, в естественных условиях не встречается;
• гидроксокобаламин (или оксикобаламин, или витамин B_12a: Со-α-[α-(5,6-диметил-бензимидазолил)]-(Со-β-гидроксо)кобамид; OH-Cbl; С₆₂H₉₀O₁₅N₁₃PCo) в котором CN^– заменена на OH^–-группу, природная активная форма витамина B₁₂ присутствующая в организмах животных, обратимо превращается в кислой среде в аквакобаламин^[10];
• аквакобаламин (или витамин B_12b: Со-α-[α-(5,6-диметил-бензимидазолил)]-(Со-β-аква)кобамид; aq-Cbl; С₆₂H₉₁O₁₅N₁₃PCo) продуцируется микроорганизмами, обратимо превращается в щелочной среде в гидроксокобаламин;
• нитрокобаламин (или витамин B_12c) в котором CN^– заменена на ONO^–-группу;
• коферментные формы витамина B₁₂: метилкобаламин и кобамамид^[11];
• диаквакобинамид^[12].

В природе обнаружены либо искусственно синтезированы кобаламины и с другими лигандами: сульфатокобаламин (SO₃-), хлорокобаламин (Cl-), бромокобаламин (Br-), тиоцианатокобаламин (SHC-), дицианокобаламин [(RCo—CN)CN]-. Возможно образование гексаперхлората цианокобаламина. Витамин B_12с образуется из витамина B_12b под воздействием азотистой кислоты, также синтезируется Streptomyces griseus^[en]. Все производные кобаламина проявляют биологическую активность витамина B₁₂. При взаимодействии с CN^-, производные превращаются в цианокобаламин. В кислой среде из цианокобаламина образуется биологический низкоактивный циано-13-эпикобаламин (неовитамин B₁₂) в котором пропионамидная группа в кольце «C» (с метильной группой) коррина пространственно расположена с другой стороны. При одноэлектронном восстановлении молекулы цианокобаламина образуется устойчивый в кристаллическом состоянии витамин B_12t c двухвалентным атомом кобальта, при двухэлектронном восстановлении получается витамин B_12s устойчивый в водных растворах и под воздействием кислорода воздуха превращающегося в витамин B_12a/B_12b в зависимости от pH раствора. Для получения меченых радиоизотопных молекул цианокобаламина либо добавляют радиоактивный изотоп ⁶⁰Co при культивировании микроорганизмов, либо к оксикобаламину добавляют синильную кислоту с изотопом ¹⁴С^[2].

B₁₂ имеет самое сложное по сравнению с другими витаминами химическое строение, основой которого является корриновое кольцо. Коррин во многом похож на порфирины (сложные химические структуры, входящие в состав гема, хлорофилла и цитохромов), но отличается от порфиринов тем, что два пятичленных гетероцикла в составе коррина соединены между собой непосредственно, а не метиленовым мостиком. В центре корриновой структуры располагается ион кобальта, образующий четыре координационные связи с атомами азота. Ещё одна координационная связь соединяет кобальт с диметилбензимидазольным нуклеотидом. Последняя, шестая координационная связь кобальта остаётся свободной: именно по этой связи и присоединяется цианогруппа, гидроксильная группа, метильный или 5'-дезоксиаденозильный остаток с образованием четырёх вариантов витамина B₁₂, соответственно. Ковалентная связь углерод-кобальт в структуре цианокобаламина — единственный известный в живой природе пример ковалентной связи переходный металл-углерод.

До освоения синтеза витамина B12 он мог добываться экстракцией из печени животных. Сначала печень, а затем её экстракт использовались в лечении пернициозной анемии^[13].

Химический синтез

Полный химический синтез цианокобаламина  (англ.) (рус. впервые был осуществлён в 1972 году в результате многолетней совместной работы двух исследовательских групп (одна из которых, руководимая Робертом Вудвордом, работала в Гарварде, а другая, возглавляемая Альбертом Эшенмозером, в Швейцарском федеральном технологическом институте в Цюрихе). Первые работы над синтезом витамина В₁₂ были начаты ещё в начале 60-х годов 20 века. На разработку общей стратегии синтеза и саму работу ушло более 10 лет. В ходе планирования синтеза, молекула была условно разделена на два основных фрагмента, синтезом которых и занимались группы, руководимые Вудвордом и Эшенмозером. Особая сложность синтеза биологически активного витамина В₁₂ была обусловлена, в частности, наличием в корриновом кольце 9 хиральных (оптически активных) атомов углерода. В общей сложности в работах по синтезу, на протяжении ряда лет, участвовали порядка 100 учёных из примерно 20 стран, а сама разработанная схема синтеза включала 95 стадий^[14][15]. Успешный полный синтез соединения столь сложной структуры явился выдающимся достижением синтетической органической химии и на практике продемонстрировал принципиальную возможность химического синтеза "любого" природного соединения, вне зависимости от сложности строения его молекулы.

Микробиологическое производство

Для получения препаратов витамина B₁₂ (в основном цианокобаламина) в промышленных масштабах для нужд медицины и сельского хозяйства используется микробиологическое производство. Для производства применяют микроорганизмы и их штаммы-мутанты, такие как^[9][16]:

• для медицинских препаратов — Propionibacterium^[en] shermanii (штамм М-82 с выходом продукта до 58 мг/л), Propionibacterium freudenreichii^[en], Pseudomonas denitrificans^[en] (штамм MB 2436 с выходом продукта до 59 мг/л). Используется глубинное культивирование;
• для кормовых концентратов витамина B₁₂ — Methanococcus^[en] halophilus (с выходом продукта 16-42 мг/л, в питательные среды также добавляются пивные или кормовые дрожжи в качестве источника некоторых питательных веществ и создания благоприятной культуральной среды для метанобразующих бактерий, а также для обогащения кормов витаминами B₂, B₆, PP). Используется метод ферментации. При производстве так же образуются сопутствующие балластные продукты как фактор А, фактор B (предшественник витамина — кобинамид), фактор III (5-оксибензилиндазол), псевдовитамин B₁₂ и ряд подобных.

Промышленное производство витамина B12 с помощью пропионовокислых бактерий включает следующие технологические стадии^[17]:

• в течение года в железобетонных ферментерах происходит непрерывное сбраживание барды комплексом бактерий;
• полученная метановая бражка сгущается;
• сгущённая масса сушится на распылительной сушилке.

Из-за того, что витамин B12 неустойчив при тепловой обработке, особенно в щелочной среде, в метановую бражку перед выпариванием добавляют хлор до оптимального значения pH 5,0—5,3, что делает среду кислой, также добавляется сульфит натрия до оптимального содержания 0,07—0,1%^[17].

В желудке желудочный сок растворяет связанный с белками пищи B₁₂. Формы в таблетках могут проходить через желудок, но для всасывания свободного B₁₂ (не связанного с белками пищи) желудочный сок не нужен. В желудке вырабатывается внутренний фактор Кастла (в некоторых источниках — «Касла»), необходимый для всасывания B₁₂ в кишечнике^[18]. R-протеин (другие названия — гаптокоррин и кобалофилин) — связывающий B₁₂ белок слюны, но действовать он начинает в желудке после того, как желудочный сок высвободит B₁₂ из белкового комплекса, тогда этот протеин связывается с ним для того, чтобы сам B₁₂ также не был разрушен желудочным соком^[19]. Затем B₁₂ соединяется с внутренним фактором Кастла — ещё одним связывающим белком, который синтезируется париетальными клетками желудка, его выработка стимулируется гистамином, гастрином, пентагастрином и непосредственно пищей. В двенадцатиперстной кишке протеазы высвобождают B₁₂ из комплекса с R-пептидом, затем B₁₂ связывается с внутренним фактором, и только в таком связанном с внутренним фактором виде он распознается рецепторами поглощающих энтероцитов подвздошной кишки. Внутренний фактор защищает B₁₂ от поедания кишечными бактериями^[20].

Закись азота нарушает метаболизм витамина B₁₂, поэтому при использовании закиси азота для анестезии (например, при стоматологических операциях) и пограничном уровне витамина B₁₂ развивается полинейропатия, вызванная дефицитом B₁₂^[21][22]. Также в зоне риска находятся люди, постоянно работающие с закисью азота, в случае плохого уровня проветривания помещений^[22]. Подобный дефицит требует терапии фолатами и B₁₂.

Биохимические функции

Ковалентная связь C—Co кофермента B₁₂ участвует в двух типах ферментативных реакций:

1. Реакции переноса атомов, при которых атом водорода переносится непосредственно с одной группы на другую, при этом замещение происходит по алкильной группе, спиртовому атому кислорода или аминогруппе.
2. Реакции переноса метильной группы (—CH₃) между двумя молекулами.

В организме человека есть только два фермента с коферментом B₁₂^[19]:

1. Метилмалонил-КоА-мутаза, фермент, использующий в качестве кофактора аденозилкобаламин и при помощи реакции, упомянутой выше в п. 1, катализирует перестановку атомов в углеродном скелете. В результате реакции из L-метилмалонил-КоА получается сукцинил-КоА. Эта реакция является важным звеном в цепи реакций биологического окисления белков и жиров.
2. 5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеин-метилтрансфераза, фермент из группы метилтрансфераз, использующий в качестве кофактора метилкобаламин и при помощи реакции, упомянутой выше в п. 2, катализирует превращение аминокислоты гомоцистеина в аминокислоту метионин.

Недостаток в организме витамина В₁₂ вследствие снижения его поступления в первую очередь из-за пониженной секреции внутреннего фактора Касла, нарушения абсорбции витамина из просвета кишечника при ряде заболеваний, при глистных инвазиях и дисбактериозах, синдроме слепой петли, реже вследствие алиментарной недостаточности из-за неполноценного питания или отсутствия транскобаламина II приводит к развитию B₁₂-дефицитной анемии^[23].

Цианокоболамин для лечебных целей выпускается промышленностью в виде растворов для парентерального введения, для целей профилактики его дефицита включается в состав ряда поливитаминных препаратов.

Оксикобаламин, кроме тех же показаний как и цианокобаламин^[24], так же применяется в качестве антидота при отравлениях цианидами и при передозировке натрия нитропруссида, так как цианистое основание более тропно к кобальту в молекуле оксикоболамина, связывает цианистое основание в безвредную форму — цианокобаламин.

Фармакокинетика

Связь с белками плазмы — 90 %. Максимальная концентрация после подкожного и внутримышечного введения — через 1 час. Период полувыведения — 500 дней. Из печени выводится с желчью в кишечник и снова всасывается в кровь^[25].

Заболевания, связанные с недостатком витамина

При недостатке витамина В₁₂ развиваются некоторые неврологические состояния и заболевания, например, анемия^[26], подострая комбинированная дегенерация спинного мозга  (англ.) (рус.^[27], полинейропатия^[26].

Обычно дефицит витамина B₁₂ лечат внутримышечными инъекциями препарата цианокобаламина. В последнее время была доказана достаточная эффективность пероральной компенсации дефицита пищевыми добавками в достаточной дозе. Суточный расход витамина B₁₂ организмом человека оценивается примерно в 2—5 мкг^[28].

Лабораторная химическая диагностика

Поскольку не существует золотого стандарта теста на дефицит витамина В₁₂, для подтверждения предполагаемого диагноза проводится несколько различных лабораторных исследований.

Сывороточное значение витамина B₁₂ является довольно неподходящим, поскольку оно изменяется поздно, а также относительно нечувствительным и неспецифичным^[29].

Метилмалоновая кислота в моче или плазме крови считается функциональным маркером витамина В₁₂, который повышается при истощении запасов витамина В₁₂. Часто для более точной оценки наряду с метилмалоновой кислотой определяют гомоцистеин^[29]. Однако повышенный уровень метилмалоновой кислоты может также указывать на часто упускаемое из виду метаболическое расстройство - комбинированную малоновую и метилмалоновую ацидурию (КМАММА) ^[30][31].

Самым ранним маркером дефицита витамина В₁₂ является низкий уровень холотранскобаламина, который представляет собой комплекс витамина В₁₂ и его транспортного белка^[29].

Обогащение кормов (включение в рацион) сельскохозяйственных животных витамином B₁₂ способствует увеличению их продуктивности до 15 %^[9].

Витамин B₁₂ не синтезируется в организме человека и поступает в организм вместе с пищей животного происхождения или с добавкой. Растительная пища практически не содержит витамина B₁₂. Всасывается витамин в нижнем отделе тонкой кишки. Несмотря на то, что он вырабатывается бактериями в толстой кишке, следующей за тонкой, толстая кишка не способна его всасывать, а в тонкой бактерии практически отсутствуют^[33]. Мало того, витамин B₁₂ бактериями также поглощается, поэтому при заболеваниях, из-за которых в тонкой кишке резко увеличивается количество бактерий, у больных может возникнуть B₁₂-ассоциированная анемия в результате соперничества в поглощении витамина между бактериями, обитающими в тонкой кишке и их носителем^[34]. Непоглощённые бактериями остатки витамина B₁₂ выводятся вместе с калом^[35].

Многие травоядные животные также не могут синтезировать, и в их кишечнике не всасывается вырабатываемый обитающими там бактериями витамин B₁₂. Однако жвачные животные, включая крупных рогатый скот, имеют специальный отдел желудка — рубец, заселённый производящими витамин B₁₂ симбиотическими бактериями, что позволяет всасывать его в тонкой кишке^[33]. После всасывания в кишечнике витамин попадает в кровь, а затем накапливается в печени и мышцах животного или попадает в молоко дойного скота^[36]. Другие травоядные животные, — кролики, мыши, крысы и некоторые виды приматов для получения витамина используют копрофагию^[33]. Свиньи и куры всеядны, поэтому витамин поступает к ним вместе с животной пищей, однако его содержание в сыром мясе этих животных ниже, чем в мясе жвачных животных^[36].

В водоёмах витамин B₁₂ производится бактериями и археями, поглощается фитопланктоном и попадает в зоопланктон. В конечном итоге, по пищевой цепи, витамин переносится в тела хищных рыб и его концентрация в мясе крупных рыб оказывается выше, чем в мясе мелких. Большое количество витамина B₁₂ накапливается в печени и почках тунца и лосося^[37]. При этом потери витамина в филе рыбы при различных видах кулинарного приготовления оказываются достаточно небольшими — от 2,3 % до 14,8 %^[38].

Хорошими источниками витамина B₁₂ для человека являются говяжья, свиная и куриная печень, мясо и молоко жвачных животных, рыба, а также ферментированные молочные продукты, такие как сыр и йогурт^[36]. Тем не менее при кулинарном приготовлении мяса (за исключением вакуумной обработки) значительное количество витамина разрушается^[39]. Потребление же яиц практически не увеличивает содержание витамина B₁₂ в крови^[36] (из яиц усваивается менее 9 % витамина)^[40]. В целом у здоровых людей из пищи усваивается лишь примерно половина содержащегося в ней витамина^[41], при этом с увеличением потребления витамина B₁₂ при приёме пищи его усвояемость уменьшается^[40].

Большинству растений витамин B₁₂ для нормальной жизнедеятельности не требуется, и они его не синтезируют^[42]. Фрукты, овощи и зерновые культуры практически не содержат витамина B₁₂^[32]. Лишь небольшое количество, менее 0,1 мкг на 100 г, обнаружили в некоторых растениях: его содержат брокколи, спаржа, Белокопытник японский и пророщенный маш, что может объясняться способностью растений всасывать витамин из некоторых органических удобрений^[43]. Так, исследования показали, что удобрение почвы коровьим навозом увеличивает содержание B₁₂ в листьях шпината примерно на 0,14 мкг на 100 г^[44]. Некоторое количество витамина присутствует в таких ферментированных продуктах, как темпе и натто, однако в самих соевых бобах, из которых эти продукты изготовлены, его обнаружить не удаётся^[45]. Небольшое количество B₁₂ может также накапливаться в растениях в результате взаимодействия с бактериями^[41].

Витамин B₁₂ обнаруживался и в плодовых телах высших грибов, не способных его синтезировать, что тоже может объясняться взаимодействием с бактериями^[42]. Обычно в съедобных грибах содержится незначительное количество витамина B₁₂ (менее 0,1 мкг на 100 г у сушёных грибов), однако некоторые грибы являются исключением. Так, в высушенных вороночнике рожковидном и лисичке обыкновенной содержание B₁₂ варьируется от 1,09 до 2,65 мкг на 100 г, а в высушенном шиитаке содержится примерно 5,6 мкг на 100 г. При этом считается, что, несмотря на значительное содержание, в шиитаке витамин также попадает извне, предположительно, в результате взаимодействия с синтезирующими B₁₂ бактериями^[46].

В пищевой промышленности витамином B₁₂ иногда обогащают такие продукты, как сухие завтраки^[47], пищевые дрожжи, соевое молоко и вегетарианские заменители мяса^[48].

Для веганов существуют рекомендации наладить регулярный приём препаратов кобаламина либо употреблять пищу, обогащённую B₁₂, так как растительная пища или не содержит в себе этого витамина, или содержит в слишком малых количествах, а организм человека синтезировать его не может. Дефицит B₁₂ у веганов ведёт к риску развития заболеваний сердца и осложнений при беременности^[49].

Важный источник витамина — пищевые добавки. Рынок пищевых добавок предлагает большое количество разнообразных вариантов: мультивитамины с обычным содержанием B₁₂ 5—25 мкг; комплексы витаминов группы B с обычным содержанием 50—500 мкг; добавки только с витамином B12 могут содержать 500—1000 мкг^[50]. Такие высокие количества обусловлены различиями форм B12 (цианкобаламин, аденозилкобаламин, метилкобаламин, гидроксикобаламин) и различиями в количестве усваиваемого витамина (например, для форм 500 мкг в одной таблетке абсорбция составляет около 2%). Маркировка добавок должна содержать наименование формы, количество на дозу и процент от рекомендованного суточного потребления.

Нормы потребления

Норма потребления, установленная в США, соответствует 2,4 мкг в день для взрослого человека^[51], а верхний предел пока не установлен^[32]. Однако расход организма соответствует 2—5 мкг в день, что может превышать установленную суточную норму потребления. Одно из исследований показало, что потребление 6 мкг в день является достаточным для поддержания нормального уровня B₁₂ в плазме крови^[51].

Злоупотребление витамином B₁₂

В выводах, сделанных по результатам статистического анализа под руководством Theodore M. Brasky, значится, что ежедневное употребление B₁₂ как отдельного витамина в течение 10 лет в повышенных дозах более 55 мкг в день увеличивает риск развития рака лёгких у мужчин на 30—40 %. Следует также обратить внимание, что существенная доля заболевших имела долгий анамнез табакокурения. У женщин данная закономерность не выявлена, хотя по результатам исследования отмечается, что в рационе исследуемых женщин витаминов группы B содержалось больше. Аналогичные же результаты выявлены и при употреблении в повышенных дозах витаминов B₆ и B₉^[53].

Под термином «псевдовитамин B₁₂» подразумевают похожие на этот витамин вещества, обнаруженные в некоторых живых организмах, например, в цианобактериях (ранее известны как сине-зелёные водоросли) рода Спирулина. Такие витаминоподобные вещества не обладают витаминной активностью для организма человека^[54][55]. Более того, эти вещества могут представлять определённую опасность для вегетарианцев, пытающихся с их помощью восполнить дефицит витамина, так как показано в опытах in vitro, что они блокируют метаболизм клеток молочной железы человека^[55]. Также их наличие в крови показывает при анализе нормальную концентрацию витамина B₁₂, хотя эти соединения не имеют витаминной активности, что может привести к ошибочному диагнозу и, в результате — к неправильному лечению пернициозной анемии.

Псевдовитамины B₁₂ синтезируются бактериями в анаэробных условиях в кишечнике некоторых животных, в частности жвачных, в канализационном шламе. Не являются витаминами для животных, но являются факторами роста для некоторых бактерий, как и сами витамины B₁₂. Структурно соответствуют цианокобаламину, но вместо 5,6-диметилбензимидазолнуклеозида содержат другие основания. К ним относятся^[2]:

• «псевдовитамин B₁₂» (или псевдовитамин B_12b, циан-β-кобаламин, циан-γ-кобаламин) — 7α-аденилкобамид цианид;
• «B₁₂-фактор» — 7α-(2-метилмеркаптоаденил)кобамид цианид;
• «Фактор III» — α-(5-оксибензимидазолил)кобамид цианид;
• «Фактор A» (или псевдовитамин B_12d, псевдовитамин B_12f, псевдовитамин B_12m, циан-ω-кобаламин) — 7α-(2-метиладенил)кобамид цианид;
• «Фактор С» — 9β-гуанозил-5пирофосфокобинамид дицианид;
• «Фактор G» — 7α-гипоксантилкобамид цианид;
• «Фактор H» — 7α-(2-метилгипоксантил)кобамид цианид;
• α-бензимидазолилкобамид цианид;
• α-(5-метилбензимидазолил)кобамид цианид;
• 7α-гуанозилкобамид цианид.

Псевдовитамины продуцируемые микроорганизмами одновременно с витаминами и обладая схожими физико-химическими свойствами, представляют определённую трудность для очистки витаминов при промышленном производстве, в частности для этих целей может применяться электрофоретическое разделение.

• Кобамамид
• Витамины группы B
• CLYBL
• Гомоцистеин

• Fumio Watanabe, Tomohiro Bito. Vitamin B12 sources and microbial interaction : [англ.] // Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.J.). — 2018. — Vol. 243, no. 2 (January). — P. 148–158. — ISSN 1535-3699. — doi:10.1177/1535370217746612. — PMID 29216732. — PMC 5788147.
• Fumio Watanabe. Vitamin B12 sources and bioavailability : [англ.] // Experimental Biology and Medicine (Maywood, N.J.). — 2007. — Vol. 232, no. 10 (November). — P. 1266–1274. — ISSN 1535-3702. — doi:10.3181/0703-MR-67. — PMID 17959839.
• Carol A. Rowley, Melissa M. Kendall. To B12 or not to B12: Five questions on the role of cobalamin in host-microbial interactions (англ.) // PLoS pathogens. — 2019. — January (vol. 15). — ISSN 1553-7374. — doi:10.1371/journal.ppat.1007479. — PMID 30605490. — PMC 6317780.
• ГОСТ Р 57201-2016 «Витамин В₁₂ кормовой. Технические условия». // М.: Стандартинформ, 2016 г.