Azotobacter

Морфологія

Клітини бактерій роду Azotobacter середнього розміру (1—2 мікрон в діаметрі), зазвичай овальні, але володіють плеоморфізмом, тобто можуть мати різну форму — від паличкоподібної до сферичної. На мікроскопічних препаратах клітини можуть розташовуватися поодинці, парами, неправильними скупченнями або, зрідка, ланцюжками різної довжини. Також можуть формувати сплячі форми — цисти, тоді як справжніх спор не утворюють.

В культурі клітини рухомі за допомогою численних джгутиків^[7]. За погіршенням умов клітини втрачають рухливість, набувають майже кокоподібної форми і утворюють товстий шар слизу, що формує капсулу клітини. На форму клітини також впливає наявність деяких хімічних компонент середовища — пептон, наприклад, викликає плеоморфізм та індукує утворення так званих «грибоподібних» кліток. Індукуючий вплив на плеоморфізм в культурах представників роду у складі пептону надає амінокислота гліцин^[8].

При мікроскопії в клітинах спостерігаються включення, частина з яких забарвлюється багатьма барвниками (наприклад, залізним гематоксиліном), а частина залишається безбарвною. На початку 20 століття вважалося, що зафарбовані включення є «репродуктивними гранулами» (гонідіями) і беруть участь в розмноженні клітини, виконуючи роль своєрідних «зародокових клітин»^[9], хоча пізніше ця гіпотеза була спростована^[10]. Зараз відомо, що зафарбовані гранули складаються з волютину (типу нуклеопротеїнів), а безбарвні є краплями жиру. Оскільки ніякої іншої функції гранул показано не було, вважається, що вони є резервним джерелом живлення^[11].

Цисти

Цисти представників роду Azotobacter стійкіші до дії несприятливих факторів зовнішнього середовища, ніж вегетативні клітини — так, цисти в два рази стійкіші до дії ультрафіолетового випромінювання, стійкіші до висушування, гамма-випромінювання, сонячної радіації, дії ультразвуку, проте не є стійкими до дії високих температур^[12].

Формування цист (інцистування) індукується зміною концентрації поживних речовин в живильному середовищі і додаванням деяких органічних речовин (наприклад етанолу, н-бутанолу і β-гідроксибутірату). Цисти рідко утворюються в рідких живильних середовищах^[13]. Утворення цист супроводжується метаболічними змінами, зокрема змінами в катаболізмі, диханні і біосинтезі макромолекул^[14]. В процесі утворення цисти беруть участь багато білків клітини, зокрема певне значення мають альдегіддегідрогеназа^[15] та регулятор відповіді AlgR^[16].

Циста Azotobacter — сферичне тіло, що складається з так званого центрального тіла: зменшеної копії вегетативної клітини з великою кількістю вакуолей, і двошарової оболонки, внутрішня частина якої називається інтима і має волокнисту будову^[17], а зовнішня називається екзина і представлена рівною структурою, що оточує цисту та має гексагональну кристалічну будову^[18]. Екзина частково гідролізуєтся трипсином і стійка до дії лізоциму, на відміну від центрального тіла^[19]. Центральне тіло може бути ізольоване в життєздатному стані деякими хелатуючими агентами^[20]. Головними компонентами зовнішньої оболонки цисти є алкілрезорціноли, що складаються з довгих аліфатичних ланцюжків і ароматичних кілець, ці речовини зустрічаються також у інших бактерій, тварин і рослин^[21].

Проростання цист

Цисти Azotobacter є сплячими формами клітини, необхідними для переживання несприятливих умов зовнішнього середовища, але не призначеними для розмноження. Після відновлення сприятливих умов, таких, як значення кислотності, температури і наявності доступного джерела вуглецю, цисти проростають, в результаті чого утворюються вегетативні клітини, що знов розмножується шляхом бінарного поділу. При проростанні цист екзина цисти ушкоджується, і вивільняється велика вегетативна клітина.

При спостереженні першою проявою проростання спор є поступове зниження переломлення світла цистами, помітне при фазово-контрастній мікроскопії або вимірюванні розсіяння світла. Проростання цист — повільний процес, що триває близько 4—6 годин, впродовж яких центральне тіло збільшується і відбувається захоплення гранул волютину, що раніше знаходилися в інтимі. Потім екзина лопається і вегетативна клітина характерної підковоподібної форми вивільняється з екзини^[22]. При проростанні цисти знову відбуваються метаболічні зміни. Відразу після збільшення концентрації джерела вуглецю цисти починають поглинати кисень і виділяти діоксид вуглецю, зокрема швидкість дихання підвищується до максимальних значень через 4 години після збільшення концентрації глюкози. Біосинтез білків і РНК також починається після збільшення концентрації джерела вуглецю у середовищі, проте активізація синтезу макромолекул відбувається повільніше після збільшення концентрації джерела вуглецю. Так, синтез ДНК і фіксація азоту ініціюються через 5 годин після збільшення концентрації глюкози у безазотному живильному середовищі^[23].

Під час проростання цист відбуваються зміни і в інтимі, видимі на електронно-мікроскопічних знімках. Інтима складається з вуглеводів, ліпідів і білків та займає майже такий же об'єм клітини, що і центральне тіло. Під час проростання цист інтима гідролізується та використовується клітиною для синтезу її компонентів^[24].

Фізіологічні властивості

Бактерії Azotobacter отримують енергію в ході окислювально-відновних реакцій, використовуючи як донора електорону органічні сполуки. Для росту їм необхідний кисень, але вони здатні рости при знижених концентраціях кисню, утворюють каталазу і оксидазу. Здатні використовувати різні вуглеводи, спирти і солі карбонових кислот як джерела вуглеця. Ці бактерії — діазотрофи (азотфіксатори), здатні фіксувати принаймні 10 мг азоту на грам спожитої глюкози, фіксація азоту залежить від наявності іонів молібдену, відсутність молібдену може бути частково заміщена іонами ванадію. Як джерело азоту можуть використовувати нітрати, іони амонію і амінокислоти. Оптимальна кислотність для росту і фіксації азоту — pH 7,0—7,5, але клітини здатні рости в діапазоні pH від 4,8 до 8,5^[25]. Можливий також залежний від водню міксотрофний ріст представників роду на безазотному живільному середовищі, що містить манозу. Оскільки водень доступний в ґрунті, ймовірно міксотрофія цих бактерій відбувається і в природних умовах^[26].

Культуральні властивості

Представники роду Azotobacter здатні використовувати вуглеводи (наприклад манітол, цукрозу, глюкозу), спирти (зокрема етанол і бутанол) і солі органічних кислот, зокрема і бензоати, як джерело вуглецю і енергії. Представники роду ростуть на безазотистих середовищах, призначених для виділення вільноживучих азотфіксуючих і олігонітрофільних організмів, наприклад на середовищі Ешбі, що містить джерело вуглецю (манітол, сахароза або глюкоза) і необхідні мікроелементи (джерело фосфора, сірки і т. д.), або на середовищі Федорова, що містить більше мікроелементів^[27], а також у рідкому середовищі Бейєрінка.

На твердих живильних середовищах представники роду утворюють плоскі, слизисті колонії пастоподібної консистенції діаметром 5—10 мм, в рідких живильних середовищах утворюють біоплівки. Характерна також пігментація, колонії представників роду можуть бути забарвлені в темно-коричневий, зелений та інші кольори, або можуть бути безбарвними, залежно від штаму. Бактерії Azotobacter є мезофільними мікроорганізмами і ростуть при температурі 20—30 °C^[28].

Пігменти

Багато представників роду Azotobacter синтезують різноманітні пігменти. Наприклад, типовий вид роду Azotobacter chroococcum виробляє темнокоричневий водорозчинний пігмент (у видовому епітеті якраз відображена ця здатність) меланін. Продукція меланіну у A. chroococcum спостерігається при високих рівнях дихання під час фіксації азоту і, ймовірно, також захищає нітрогеназну систему від дії кисню при аероадаптації^[29]. Інші види роду також продукують пігменти від жовто-зеленого до пурпурного кольору^[30]. Також представники роду здатні виробляти флюоресцентний пігмент, що випромінює жовто-зеленим кольором, і пігмент, що випромінює біло-блакитним кольором^[31].

Геном

Частково завершено визначення нуклеотидної послідовності хромосоми Azotobacter vinelandii штаму AvOP. Хромосома A. vinelandii — кільцева молекула ДНК розміром 5342073 пар основ, що містить 5043 генів, з яких 4988 кодують білки, вміст ГЦ становить 65 %^[32]. Відмічена також зміна плоїдності бактерій Azotobacter в міру «старіння» культур: кількість хромосом в клітинах та вміст ДНК збільшується в стаціонарній фазі, де бактерії можуть містити понад 100 копій хромосоми на клітину. При пересіванні на свіже живильне середовище первинний вміст ДНК (одна копія) відновлюється^[33]. Крім хромосомної ДНК, у представників роду також знайдені плазміди^[34] та показана можливість трансформації бактерій екзогенною плазмідою^[35].

Рід Azotobacter був вперше описаний в 1901 році голландським мікробіологом і ботаніком, одним із засновників екологічної мікробіології Мартінусом Бейєрінком на основі вперше виділеного та описаного їм виду Azotobacter chroococcum, першого відомого аеробного вільноживучого діазотрофа^[36].

В 1903 році Ліпман (Lipman) описав вид Azotobacter vinelandii Lipman, 1903, а роком пізніше Azotobacter beijerinckii Lipman, 1904, названий їм на ім'я самого Мартінуса Бейєрінка. В 1949 році радянський мікробіолог Микола Олександрович Красильников описав вид Azotobacter nigricans Krasil'nikov, 1949, в 1981 році розділений Томпсоном (Thompson) и Скерманом (Skerman) на два підвиди:Azotobacter nigricans subsp. nigricans Krasil'nikov, 1949 і Azotobacter nigricans subsp. achromogenes Thompson and Skerman, 1981, в тому же році Томпсон і Скерман описали вид Azotobacter armeniacus Thompson and Skerman, 1981^[37]. В 1991 році Пейдж (Page) і Шивпрасад (Shivprasad) описали мікроаерофільний, залежний від іонів натрію аеротолерантний вид Azotobacter salinestris Page and Shivprasad 1991^[38].

Спочатку рід відносили до родини Azotobacteraceae Pribram, 1933, проте пізніше він був перенесений до родини Pseudomonadaceae, засновуючись на молекулярно-систематичних дослідженнях нуклеотидних послідовностей 16S рРНК. У 2004 році було проведене філогенетичне дослідження, яке виявило, що Azotobacter vinelandii входить до одної клади з бактерією Pseudomonas aeruginosa^[39], а в 2007 році було зроблене припущення про близькість родів Azotobacter, Azomonas і Pseudomonas та про можливу синонімічність^[40].

До роду Azotobacter раніше також відносили види Azotobacter agilis (в 1938 році перенесений Виноградським до роду Azomonas), Azotobacter macrocytogenes (перенесений в 1981 році до роду Azomonotrichon, а в 1982 році, із скасуванням Azomonotrichon, до роду Azomonas) і Azotobacter paspali (перенесений в 1981 році до роду Azorhizophilus).

Представники роду поширені повсюдно в нейтральних і слаболужних ґрунтах, але не виділяються з кислих ґрунтів^[41]. Також вони були знайдені і в екстремальних умовах ґрунтів північного і південного полярних регіонів, незважаючи на короткі місцеві вегетаційні сезони і відносно низькі значення pH, — у арктичному регіоні в глині і суглинках (зокрема торф'яних і піскових суглинках), в антарктичному регионе — у ґрунті узбережжя^[42]. Чисельність Azotobacter в ґрунті не дуже велика, так в ґрунтах Індії вони не перевищують 10-100 тис./г ґрунту. Чисельність цих бактерій сильно залежить від наявності інших мікроорганізмів: існують як мікроорганізми, що стимулюють ріст Azotobacter, так і ті, що запобігають їх інтенсивному росту^[43]. В сухих ґрунтах бактерії Azotobacter здатні зберігатися у вигляді цист до 24 років^[44].

Також бактерії Azotobacter були виділені з водних середовищ, зокрема з прісноводних водойм^[45], солоневатих боліт^[46]. Деякі представники роду асоційовані з рослинами та були знайдені в ризосфері, вступаючи з рослинами в певні взаємовідносини^[47] — кілька штамів роду були виділені з різосфери мангрових дерев, спільно з іншими азотфіксуючими та денітрифікуючими бактеріями^[48].

Деякі штами Azotobacter також були знайдені в коконах дощових черв'яків Eisenia fetida^[49].

Бактерії Azotobacter є вільноживучими діазотрофами, тобто здатні фіксувати атмосферний азот, але на відміну від класичних діазотрофів роду Rhizobia, зазвичай не вступають в симбіотичні відносини з рослинами, хоча з цього правила є кілька виключень в межах роду^[50]. Фіксація азоту інгібується наявністю доступних джерел зв'язаного азоту, наприклад іонів амонію або нітратів^[51].

Представники роду мають повний комплекс ферментів, необхідних для здійснення фіксації азоту: ферредоксини, гідрогенази і найважливіші ферменти — нітрогенази. Процес фіксації азоту енергозалежний і вимагає притоку енергії у вигляді АТФ. Також цей процес украй чутливий до присутності кисню, тому у представників Azotobacter виробився особливий механізм захисту від дії кисню — так званий дихальний захист, що здійснюється шляхом значної інтенсифікації дихання, найбільшої серед всіх відомих бактерій, що дуже значно знижує концентрацію кисню в клітинах^[52]. Також ці бактерії мають специфічний для них білок Shethna, що захищає нітрогеназу та бере участь в запобіганні смерті клітини, викликаній кисневим стресом: мутанти, що не виробляють цей білок, гинуть за умовами наявності кисню під час фіксації азоту (тобто за умовами відсутності джерела зв'язаного азоту в середовищі)^[53]. Певну роль в процесі фіксації азоту бактеріями Azotobacter грають також іони гомоцитрату^[54].

Нітрогенази Azotobacter

Нітрогеназний комплекс є найважливішим ферментом, що бере участь у фіксації азоту. У представників роду виявлено кілька типів нітрогеназ — Mo-Fe-нітрогеназа^[55] і альтернативні нітрогенази: ванадій-залежна^[56][57][58], активніша, ніж Mo-Fe-нітрогеназа за умовами низьких температур (у дослідженнях ефективна фіксація азоту не припинялася V-нітрогеназою при зниженні температур до 5 °C, за цими умовами активність V-нітрогенази знизилася в 10 разів менше, ніж у Mo-Fe-нітрогенази^[59]), і Fe-залежна, менш активна, ніж звичайна Mo-залежна нітрогеназа^[60][61].

Важливу роль в утворенні активної нітрогенази грає визрівання Р-домену Mo-Fe-нітрогенази^[62], а попередник Mo-Fe-кофактору нітрогенази^[63], шаперон GroEL, грає важливу роль у завершенні формування нітрогенази^[64]. Регуляція активності нітрогенази може здійснюватися утворенням комплексів аргініну^[65]. Синтез нітрогенази здійснюється під контролем групи т. з. nif-генів^[66]. Фіксація азоту регулюється nifLA опероном, один з продуктув якого, NifA, регулює транскрипцію nif-генів, а NifL має антагоністичну дію по відношенню до дії NifA у відповідь на поглинений азот і залежно від рівня надходження кисню до клітини, експресія оперону nifLA регулюється за механізмом позитивної регуляції^[67]. NifL є флавопротеїном, що модулює активацію транскрипції генів фіксації азоту шляхом редокс-залежного перемикання^[68]. Двокомпонентна регуляторна система, що складається з двох білків (енхансера NifA і рецептора NifL), створюючих комплекси між собою, є атиповою для представників роду, але не поширеною серед інших організмів системою регуляції експресії генів^[69].

Азотистий обмін ґрунту

Фіксація азоту грає велику роль в кругообігу азоту в природі. Зокрема, фіксація азоту є найважливішим джерелом азоту, а представники роду Azotobacter грають важливу роль в кругообігу азоту ґрунту, здійснюючи фіксацію молекулярного азоту. Також представники роду синтезують деякі біологічно активні речовини, у тому числі і деякі фітогормони, наприклад ауксини^[70], тим самим стимулюючи ріст та розвиток рослин^[71] і являючись біологічним стимулятором росту рослин і синтезуючи фактори, необхідні для їх росту^[72]. Екзополісахариди представників роду сприяють мобілізації важких металів в ґрунті, сприяючи самоочищенню ґрунтів, забруднених такими металами, як кадмій, ртуть і свинець^[73]. Деякі представники роду Azotobacter також здібні до біодеградації деяких ароматичних сполук, що містять хлор, наприклад 2,4,6-трихлорфенолу, що раніше використовувався як інсектицид, фунгіцид і гербіцид, проте має мутагенну і канцерогенну дію та є ксенобіотиком і типовим компонентом забруднення сільськогосподарських ґрунтів^[74]. Також Azotobacter виробляє деякі речовини, що запобігають росту певних патогенів рослин, таких як Alternaria, Fusarium і Helminthosporium, таким чином виступаючи в ролі агенту біологічної боротьби зі шкідниками^[43].

Використання людиною

Завдяки своїй здатності фіксувати молекулярний азот, тим самим підвищуючи родючість ґрунтів і стимулюючи ріст рослин, бактерії Azotobacter широко використовуються в сільському господарстві^[75], особливо в колишньому СРСР^[43], зокрема для отримання азотних біодобрив, в тому числі азотобактерину^[76], також представники роду виробляють такі полісахариди як альгінова кислота (E400)^[77][78][79], що використовується в медицині як антацид, в харчовій промисловості як добавка до мозорива і кремів та в біоабсорбції металів^[80] і полі-3-гідроксибутірат^[81]. Azotobacter beijerinckii синтезує рестриктазу Abe I, що розпізнає асиметричну семинуклеотидну послідовність CCTCAGC^[82].

• Азотобактер (Azotobacter) // ВУЕ
• Азотобактер // УРЕ
• Azotobacter. MicrobeWiki. Архів оригіналу за 21 червня 2013. Процитовано 17 січня 2009. — The student-edited microbiology resource (англ.)
• J. P. Euzéby. Azotobacter Beijerinck 1901. List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature. Архів оригіналу за 21 червня 2013. Процитовано 17 січня 2009. (англ.)
• Azotobacter.org. Архів оригіналу за 21 червня 2013. Процитовано 17 січня 2009. — Сайт проекту дослідження геному Azotobacter vinelandii (англ.)
• Amy Crum. Azotbacter. Soil microbiology/CSES 4684. Архів оригіналу за 21 червня 2013. Процитовано 17 січня 2009. (англ.)
• Azotobacter vinelandii. John Innes Centre — Molecular Microbiology Department. Архів оригіналу за 21 червня 2013. Процитовано 17 січня 2009. (англ.)
• Azotobacter vinelandii. JGI. Архів оригіналу за 21 червня 2013. Процитовано 17 січня 2009. (англ.)
• Iwao Watanbe (JICA/Cantho Univ. expert Mar-Apr. 2000) (30 березня 2000). Biological Nitrogen Fixation and its Use in Agriculture. Lecture in Cantho University, Vietnam. Архів оригіналу за 21 червня 2013. Процитовано 17 січня 2009. (англ.)
• Azotobacter. Microbiology Video Library. MicrobiologyBytes. Архів оригіналу за 21 червня 2013. Процитовано 17 січня 2009. (англ.)